miR-223靶向调控p120/NF-κB信号通路在人气道上皮细胞炎症反应中的作用及其分子机制

摘要

本文从以下几个方面进行论述： 第一部分：LPS诱导人气道上皮细胞炎症反应中miR-223表达变化及对NF-κB活性的调控 目的： 本实验借助内毒素脂多糖（LPS）刺激体外培养的人气道上皮细胞来构建炎症反应的体外模型，检测miR-223及连环素p120（p120）表达变化及其对NF-κB信号通路的影响，初步探讨LPS所致气道炎症的分子机制。 方法： 根据本实验室前期研究及相关文献，采用CCK8检测不同浓度LPS（0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、100μg/ml及200μg/ml）对细胞活性的影响。根据CCK8结果，选取20μg/ml LPS作为刺激条件，采用Western Blot检测不同时间点p120、p-IKK、IKKα、p-IκB、IκBα、p-p65及NF-κB p65蛋白的表达变化，运用Real-time PCR检测p120 mRNA水平以及miR-223的表达情况。选取p120变化最明显的时间点6h作为LPS刺激时间，分别转染miR-223类似物、miR-223抑制物及各自阴性对照miRNA，采用ELISA或Real-time PCR检测NF-κB下游IL-1β、IL-6、IL-8以及COX-2的表达变化。采用Western Blot检测NF-κB通路中蛋白表达变化。采用核浆分离检测p65的入核情况及免疫荧光检测NF-κB p65表达及分布的改变。采用Real-time PCR检测p120 mRNA水平以及miR-223的表达情况。 结果: (1) CCK8结果显示，不同浓度的LPS刺激气道上皮细胞，作用不同时间均能轻微刺激细胞增殖，各组间差异无统计学意义（p＞0.05）。 (2) Western Blot检测发现20μg/ml LPS刺激16HBE可激活NF-κB通路，p-IKKα/β、p-IκBα及p-p65表达增高，IKKα及IκBα呈现先减少后升高的趋势。p120蛋白表达降低呈时间依赖性，Real Time PCR显示：miR-223在LPS刺激后表达上升，p120 mRNA表达下调。 (3)将miR-223类似物、miR-223抑制物及各自阴性对照组转入16HBE细胞24h后给予LPS处理。RT-PCR检测发现，miR-223类似物转入细胞24h后再给予LPS刺激，NF-κB下游靶蛋白COX-2、IL-6及IL-8的胞内mRNA水平明显高于仅LPS刺激组（p＜0.05），转入miR-223抑制物后与LPS单一刺激无明显差异。 (4) Western Blot实验发现，与仅LPS刺激组对比，转入miR-223类似物后的细胞p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65表达增加更加明显。核浆分离实验证实miR-223可以促进p65的入核，免疫荧光检测显示p65在核内分布更多，ELISA检测NF-κB p65的磷酸化明显增高。 (5) Western Blot及RT-PCR检测p120的表达，结果显示miR-223过表达使p120的蛋白水平及mRNA水平均降低（p＜0.05）。 结论: 在LPS刺激诱导的气道炎症反应中，miR-223可能通过调控NF-κB通路，从而对炎症反应起到调节作用。 第二部分:LPS诱导人气道上皮细胞炎症反应中，miR-223调控NF-κB信号通路的可能分子机制 目的: 在体外LPS刺激的气道上皮炎症反应模型中，改变miR-223及p120水平观测LPS刺激后p120及NF-κB信号通路中各蛋白表达的相应变化，进一步探讨气道炎症反应中miR-223调控NF-κB信号通路的可能分子机制。 方法: 人气道上皮细胞16HBE细胞转入miR-223类似物或阴性对照，以及同时转入miR-223类似物、p120质粒1A或miR-223类似物、p120质粒3A组合，给予LPS刺激。采用ELISA检测IL-8的分泌，RT-PCR检测COX-2、IL-6、IL-8、p120的mRNA水平变化。采用免疫印记实验对细胞p120蛋白表达及NF-κB通路进行检测。采用免疫荧光实验来检测细胞中p65的分布情况，ELISA实验检测NF-κB p65的磷酸化情况。转染不能与RhoA结合的p120DRDD质粒后，Western Blot检测细胞内RhoA表达情况，G-LISA检测细胞RhoA活性。 结果: (1) ELISA结果显示，同时转染miR-223类似物及p120质粒1A或者同时转染miR-223类似物及p120质粒3A，这两组与转染miR-223类似物后LPS刺激和仅LPS刺激组比较，IL-8分泌均呈现下降趋势，RT-PCR检测IL-8 mRNA具有同样的趋势，并且mRNA表达下降更明显，差异显著（p＜0.05）。COX-2、IL-6的mRNA水平在转入p120质粒后均有下降。 (2) Western Blot及RT-PCR结果显示，在转入p120质粒后细胞内p120蛋白及mRNA水平均明显升高。同时转染miR-223类似物及1A或者同时转染miR-223类似物及3A，这两组与转染miR-223类似物后LPS刺激和仅LPS刺激组比较，Western Blot检测发现p-p65表达明显下降，p120高表达时，miR-223促进NF-κB信号通路活化的作用受到部分抑制； (3)免疫荧光实验发现，转入p120质粒后，miR-223促进p65入核作用减弱。 (4) ELISA结果显示，转入p120质粒后，miR-223促进NF-κB p65磷酸化的作用减弱。 (5) G-LISA结果显示，转入miR-223及LPS刺激均使细胞内RhoA活性明显增加，转入p120质粒后RhoA活性下降。转入不能与RhoA结合的p120DRDD质粒与转入p1203A质粒组比，miR-223及LPS刺激明显增强细胞RhoA活性。 结论: 在气道炎症反应过程中，miR-223可能通过靶向负性调节p120的表达，增强RhoA活性，而实现对NF-κB信号通路的调控。

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中 文 摘 要

Abstract

第 一 部 分

在LPS诱导的人气道上皮细胞炎症中miR-223表达变化及对NF-κB活性的调控

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第 二 部 分

LPS诱导人气道上皮细胞炎症反应中miR-223调控NF-κB信号通路的可能分子机制

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

综 述

miRNAs与溃疡性结肠炎及结直肠癌的相关性研究进展

1.miRNA与溃疡性结肠炎的相关性

1.1 溃疡性结肠炎的概述

1.2 miRNAs与溃疡性结肠炎的发生

1.3 miRNAs与溃疡性结肠炎的诊断、活动度评估和预后判断

2.miRNA与结直肠癌的相关性

2.1结直肠癌的流行病学

2.2 miRNAs与结直肠癌的发生发展

2.3 miRNAs参与调节结直肠癌化疗敏感性

2.4 miRNAs在结直肠癌的临床诊断中的意义

3.小结

参考文献

[42] Pekow J, Meckel K, Dougherty U, et al. Increa

[48] Signs SA, Fisher RC, Tran U, et al. Stromal?m

[62] Perreault N. Ulcerative Colitis-Associated Ca

[70] Hu XX, Xu XN, He BS, et al. microRNA-485-5p F

[71] Li Y, Gong P, Hou JX, et al. miR-34a Regulate

附 录

攻读博士学位期间发表论文目录

致 谢