叶酸壳寡糖修饰的PLGA纳米粒作为抗肿瘤载体的研究

摘要

纳米载药系统作为肿瘤药物的载体具有高效、低毒和缓释的优点,经过配体修饰的纳米粒,可特异性地被肿瘤细胞摄取,降低药物对正常细胞的损害。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是从红豆杉属植物的树皮中提取得到的二萜类化合物,具有独特的微管稳定作用,临床上主要适用于卵巢癌和乳腺癌。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是聚酯类高分子材料,由乳酸和羟基乙酸聚合而成,其在体内的最终代谢产物为水和二氧化碳,具有良好的生物可降解性和组织相容性,作为药用辅料已被美国FDA批准。端羧基PLGA(PLGA-COOH)是在聚合时保留聚合物链末端的羧基,以便可以对聚合物进行进一步的改性反应。叶酸是人体必需的一种维生素,但人体无法自行合成,必须从食物中摄取。叶酸受体是细胞膜表面的一种糖蛋白,叶酸与叶酸受体结合后,细胞通过内吐作用摄取叶酸。叶酸受体在肺、胸腺、肾等正常组织中呈低水平表达,而在一些肿瘤组织呈高水平表达。用叶酸对纳米载药系统进行修饰可以赋予纳米载药系统主动靶向性。
　　 本课题以端羧基PLGA为载体,制备了载紫杉醇的PLGA纳米粒。以载药量、包封率、纳米粒的粒径为主要考察指标,优化了紫杉醇PLGA纳米粒的处方和制备工艺。采用乳化溶剂挥发法制备纳米粒,通过单因素实验对纳米粒的处方和制备工艺进行了优化。优化得到的处方和制备工艺为:1mg紫杉醇、50mgPLGA溶于2.5mLCH2Cl2,乳化剂选用30mL2％PVA,超声条件为:超声2s,间歇2s,超声10min后将初乳倒入400 r·min-1搅拌下的等体积的纯化水中,搅拌4h挥发有机溶剂。制备得到的纳米粒平均粒径为284nm,载药量为1.13%±0.09%,包封率为57.77%±1.16%。采用界面沉积法制备紫杉醇:PLGA纳米粒,通过因子设计-效应面法对纳米粒的处方和制备工艺进行优化。优化得到的处方和制备工艺为:紫杉醇2mg、PLGA60mg,溶于6mL丙酮中作为有机相,在800r·min-1搅拌下,将有机相逐滴加入30mL的1%PVA溶液中,搅拌约10min后将转速减至400r·min-1,继续搅拌5h使丙酮挥干,得到带蓝乳光的澄清溶液,0.45μm微孔滤膜滤过后即得纳米粒混悬液,得到的纳米粒粒径为281±1nm,电位为-30.1±0.3mV,包封率为57.43%±1.61%。由于界面沉积法制备纳米粒具有制备简单,包封率较高等优点,最终以界面沉积法制备紫杉醇PLGA纳米粒。
　　 采用碳二亚胺法制备了叶酸偶联的壳寡糖。用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)对叶酸的羧基进行活化,再与壳聚糖和壳寡糖上的氨基结合即得,并用紫外光谱和红外光谱对产物进行了确证。以叶酸的浓度及其对应的在363nm处的吸光值,计算得到了叶酸的标准曲线:A=8.1789C+0.0681,R=0.9999(其中浓度单位为mg·mL-1)。将制备得到的叶酸壳寡糖溶于水后测定其在363nm处的吸光值,计算叶酸偶联率。最后确定的反应条件为:叶酸约220mg,EDC·HCl约192mg,溶解于30mL0.1mol/LNaOH溶液中,加入约525mg壳寡糖,搅拌下加入叶酸溶液,室温下避光反应16h。反应结束后用0.1mol/L HCl调节反应液pH至7后过滤,将滤液用大量纯化水透析24h后冻干即得叶酸壳寡糖。该法制备的叶酸壳寡糖的叶酸偶联率约为24.39%。
　　 用叶酸偶联的壳寡糖对PLGA纳米粒修饰。用EDC对PLGA纳米粒表面的端羧基进行活化,再与叶酸壳寡糖上的氨基连接。反应条件为:称取30mg叶酸壳寡糖和约2mgEDC,用10mL纯化水溶解,搅拌下,加入纳米粒混悬液,室温下反应3h,0.45μm微孔滤膜滤过即得叶酸壳寡糖修饰的PLGA纳米混悬液。修饰后的纳米粒粒径为321±0.76nm,电位为22.6±0.26mV,载药量5.1±0.25%,包封率41.96±1.96%,纳米粒的叶酸偶联率约为8.87%。
　　 在体外细胞实验时,选用了SKOV-3卵巢癌细胞系,用MTT法考察了紫杉醇纳米粒混悬液及紫杉醇溶液对细胞的抑制效果。通过前期实验,初步筛选出最佳紫杉醇浓度为0.1μg·ml-1,作用时间为48h。实验显示紫杉醇在作用时间48h时对细胞的抑制作用达到最大,48h后,紫杉醇溶液对细胞的抑制作用开始下降。而纳米粒随着作用时间的延长,对细胞的抑制率上升。在作用时间96h时,修饰后纳米粒对细胞的抑制率与紫杉醇溶液对细胞的抑制率相当。在不同作用时间下,修饰后紫杉醇纳米粒对细胞的抑制率均强于相同浓度的未经修饰的纳米粒。