AFP抗体修饰PLGA荷载DCN的纳米粒靶向抗肿瘤药物

摘要

一种AFP抗体修饰PLGA荷载DCN的纳米粒靶向抗肿瘤药物，是以DCN重组质粒作为核心治疗药物，选择高度特异性肝癌靶向性AFP单抗分子，采用以可降解性高分子生物材料制备的载药纳米粒聚乳酸/乙醇酸复合物(PLGA)荷载DCN抗癌基因质粒并偶联肝癌靶向性AFP单抗分子，构建成AFP mAb-PLGA-rhDCN治疗性纳米粒子。本发明药物能够主动结合肝癌细胞并进入细胞内，缓慢释放DCN质粒，实现对肝癌细胞的特异靶向抑制作用。本发明药物提高了转染基因的作用效率，同时实现了目的基因对靶细胞的长效抑制作用，用于原发性肝细胞癌的靶向治疗，具有极大的市场潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种靶向抗肿瘤药物，特别是涉及一种针对原发性肝细胞癌的靶向治疗药物。

背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见且死亡率最高的恶性肿瘤之一。我国HCC发病率位居世界首列，且仍逐年增长，是严重威胁我国人民健康的重大疾病。HCC因恶性度高、转移早、复发率高等特点而严重制约其疗效，加上传统治疗方法对机体免疫功能带来的极大负面影响，使肿瘤进展加速、加剧，预后极差。关注并大力开展HCC治疗研究，对我国尤具十分重要和现实的社会及医学意义。随着分子生物学和免疫学的不断发展，对HCC发生、发展机制认识的不断深入，HCC的基因靶向治疗已成为肿瘤临床研究的热点。

传统基因载体系统分为病毒载体和非病毒载体两类，现有病毒载体存在免疫原性、致瘤性的缺陷；非病毒载体则存在着低传递效率的问题。同时，这些基因转染的方式都缺少细胞靶向性，并且载体携带的目的基因通过转染作用于肿瘤细胞后，往往会在短时间内被细胞内的酶消化破坏，作用时间短，生物利用度低。这些问题导致了传统基因治疗效果不佳，已经成为限制基因治疗进一步发展的瓶颈。

纳米基因载体是一种新型的基因载体系统，其以纳米颗粒为载体，将治疗基因包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面，通过细胞内摄作用使纳米颗粒进入细胞并释放治疗基因，从而发挥基因治疗效能。聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)纳米颗粒是一种具有良好生物相容性及降解性的生物材料，已被美国FDA批准在人体内使用。PLGA纳米颗粒还具有核苷酸保护作用，通过对PLGA末端的活性羧基进行修饰，可以偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性。

核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是蛋白聚糖(proteoglycan，PG)家族的一个多效性分子，通过核心蛋白调控细胞周期及结合细胞因子等调节细胞增殖、分化与基质形成。近年大量资料表明：1) DCN是一种有效的肿瘤细胞生长与迁移抑制剂，可抑制多种不同组织来源的肿瘤细胞生长，并诱导其凋亡；2) 新近又发现DCN是Met(HGFR)的对抗性配体，在防止肿瘤侵袭、浸润和转移中发挥作用；3) DCN还能逆转肿瘤细胞抗药性。

DCN对多种靶点复杂的结合能力及引人注目的抗肿瘤作用，充分表明其在肿瘤治疗中的药用价值。国外学者采用腺病毒载体进行的DCN基因治疗研究显示，DCN有局部和远程特异性抗肿瘤作用。有个别报道，DCN含量减少可作为预测不良预后的指标。本课题组前期研究资料表明，无论DCN在体内过度表达，或作为重组蛋白或基因转染细胞，均可抑制多种不同组织来源的肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡，而且DCN能逆转肿瘤细胞抗药性。

发明内容

本发明的目的是针对传统基因载体存在的问题，提供一种基于新载体的AFP抗体修饰PLGA荷载DCN的纳米粒靶向抗肿瘤药物。

本发明所述的AFP抗体修饰PLGA荷载DCN的纳米粒靶向抗肿瘤药物基于DCN抑制肿瘤细胞增殖、转移、肿瘤血管生成及逆转肿瘤细胞抗药性等多重抗肿瘤作用，以DCN重组质粒作为核心治疗药物，选择高度特异性肝癌靶向性AFP单抗分子，采用以可降解性高分子生物材料制备的载药纳米粒聚乳酸/乙醇酸复合物(PLGA)荷载DCN抗癌基因质粒并偶联肝癌靶向性AFP单抗分子，构建AFP mAb-PLGA-rhDCN治疗性纳米粒子。

本发明所述AFP抗体修饰PLGA荷载DCN的纳米粒靶向抗肿瘤药物的制备方法是将PLGA分散于二氯甲烷溶液中作为油相，pIRES2-EGFP-DCN质粒分散于1wt% PVA水溶液中作为水相，将所述油相与水相混合制成初乳；将所述初乳滴入0.3wt% PVA水溶液中搅拌形成复乳；除去复乳中的二氯甲烷，离心收集纳米粒子，悬浮于pH7.4的PBS缓冲液中制成纳米粒分散体系；向纳米粒分散体系中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应得到活化的纳米粒，加入AFP单抗，反应得到AFP mAb-PLGA-rhDCN治疗性纳米粒子。

其中，加入的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2∶1。

进一步地，本发明上述制备方法中，所述活化是在室温下搅拌反应40min；所述抗体偶联反应时间6h。

本发明的靶向抗肿瘤药物利用肝癌细胞分泌AFP及抗体与抗原特异性结合的特性，使得AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒子能够主动结合肝癌细胞并进入细胞内，缓慢释放DCN质粒并表达DCN基因编码的相应产物，发挥其抗肿瘤效应，实现DCN对肝癌细胞的特异靶向抑制作用。本发明的靶向抗肿瘤药物避免了利用脂质体等转染方法转入细胞的基因被迅速降解的问题，提高了转染基因的作用效率，同时实现了目的基因对靶细胞的长效抑制作用。

本发明制备的靶向抗肿瘤药物可用于原发性肝细胞癌的靶向治疗，具有极大的市场潜力。

附图说明

图1为本发明制备的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒的外观形态图。

图2为本发明制备的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒的粒径分布图。

图3为本发明制备的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒的Zeta电位图。

图4为本发明制备的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒的体外释放曲线图。

图5为本发明制备的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒进入HepG2细胞的情况。

图6为不同浓度AFP mAb-DCN-PLGA纳米粒对HepG2细胞的增殖抑制率。

图7为不同浓度AFP mAb-DCN-PLGA纳米粒对HepG2细胞转移能力的影响。

图8为不同浓度AFP mAb-DCN-PLGA纳米粒对HepG2细胞侵袭能力的影响。

具体实施方式

实施例1

取20mg PLGA加入1ml二氯甲烷中，使聚合物分散均匀作为油相(O)；取溶有500μg pIRES2-EGFP-DCN质粒的1wt% PVA水溶液2ml作为水相(W1)。将油相(O)与水相(W1)混合，冰水浴超声5min(超声功率300W，超1s停2s)，得到初乳(W1/O)。然后将得到的初乳滴入10ml 0.3wt%PVA水溶液(W2)中，磁力搅拌5min形成复乳(W1/O/W2)。将得到的复乳旋蒸除去二氯甲烷，离心得到PLGA-rhDCN纳米粒。

将得到的PLGA-rhDCN纳米粒悬浮于2mL PBS缓冲液中制成分散体系，再加入200μg EDC和NHS的混合物(EDC与NHS的摩尔比为20∶10)，室温搅拌反应40min，10000r/min离心5min，得到活化的PLGA-rhDCN纳米粒沉淀。收集沉淀，用2ml PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤两次，重新分散于PBS缓冲液中，加入200μg AFP单抗，搅拌反应6h，PBS反复离心、洗涤，得到AFP mAb-DCN-PLGA纳米粒，冻干保存。

实施例2

取实施例1制备的纳米粒10μg分散于1ml PBS缓冲液中制成混悬液，滴于镀碳支持膜(电镜铜网)上，晾干。在扫描电子显微镜下观测到图1所示的纳米粒形貌特征。图中A为×4000倍，B为×5000倍。利用激光粒度仪测定纳米粒的粒径分布范围及Zeta电位，结果如图2和图3，纳米粒的粒径范围主要分布在100～300nm之间，Zeta电位在-20～-13mV之间。

由图1、图2和图3可知，所制备的纳米粒粒径大小属于细胞可摄取的最佳范围。若制备的纳米粒粒径过大，会导致粒子难以进入细胞，粒径太小，则可能会破坏所包载基因的生物结构，同时使偶联抗体的有效性下降，失去其靶向抗肿瘤作用。本发明制备的纳米粒在保证有效包裹所荷载的目的基因质粒，以保证纳米粒结构功能完整性的前提下，尽可能做到了使纳米粒的粒径最小化，便于细胞摄取。

实施例3

取实施例1制备的纳米粒20μg，重悬于装有3ml PBS缓冲液的离心管中并封口，将离心管置于37℃恒温振荡器内，100r/min离心，分别于1h，12h，24h，36h，48h，72h及此后每隔24h离心，取2ml上清，检测释放的质粒量，同时补充2ml新鲜PBS缓冲液，继续恒温振荡，直至240h的时间点。计算累积释放率，绘制曲线如图4。

经测量得到第一个24h的累计释放率平均值为35.01%，之后缓慢释放，在240h时释放率达到79.3%。

在图4结果中，由于部分载基因质粒吸附于纳米材料上形成不稳定结合，从而导致在开始的24h内出现释放率突然增高现象。这种突释现象可以使药物在肿瘤组织迅速形成一个较高的治疗浓度，快速发挥其抗肿瘤作用。之后随着PLGA在细胞内的逐渐降解，持续缓慢平稳释放所包载的基因，实现了DCN对HepG2细胞的长期抑制作用，并且避免了利用脂质体等转染方法进入细胞的基因的迅速被降解，提高了基因的作用效率。

实施例4

以IgG抗体代替AFP 单抗，其他与实施例1步骤完全相同，制备得到IgG-DCN-PLGA纳米粒，作为AFP mAb-DCN-PLGA纳米粒对照试验用材料。

实施例5

先分别对抗体进行羧基荧光素(FAM)标记，对载DCN质粒的PLGA-rhDCN纳米粒PLGA纳米粒子进行罗丹明(Rhodamine)荧光标记，用Hoechst33342标记细胞核。再按照实施例1与4所述步骤，分别制备出双荧光标记的纳米粒。

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于六孔板中，培养12h后，取10μg荧光标记的AFP mAb-DCN-PLGA纳米粒与细胞共同孵育作为实验组，10μg荧光标记的IgG-DCN-PLGA纳米粒与细胞共同孵育作为阴性对照组，分别在4h、12h时，在激光共聚焦显微镜×630倍下(488nm激发FAM，543nm激发罗丹明，350nm激发Hoechst33342)观察两种荧光的共定位情况。

结果如图5所示，其中蓝色荧光标记细胞核，绿色和红色荧光对纳米粒子进行双荧光标记，黄色荧光为绿色与红色荧光重叠后颜色。实验组(a)细胞核周围有大量荧光聚集，说明AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒有生物靶向作用，HepG2细胞可主动摄取AFP单抗修饰的纳米粒，且作用时间越长，摄取量越多；而阴性对照组(b)细胞核周围只有少量荧光聚集，说明无靶向作用的IgG不能介导纳米粒大量进入细胞。

实施例6

通过MTT实验评价AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒对HepG2细胞的抑制作用。取对数期的HepG2细胞接种于96孔板，180μL DMEM培养液培养12h，取20μL终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒加入培养细胞中分别作为低、中、高剂量实验组，取20μL稀释好的IgG-DCN-PLGA纳米粒加入培养细胞中作为阴性对照组，以不加入纳米粒的培养细胞作为空白对照组，孵育24h、48h、72h后，弃去培养液，加入不含血清的新鲜DMEM培养液100μL及20μL MTT溶液，孵育4h后弃去培养液，每孔加150μL DMSO，使用酶标仪在490nm下测定各孔OD值，每组设三个复孔。纳米粒对细胞的相对抑制率按下式计算：(空白孔OD值－实验孔OD值)/空白孔OD值×100%。

实验结果如图6所示，与IgG非特异性抗体组相比，实验组的AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒对HepG2细胞的增殖抑制率明显增高，且随作用浓度的升高而增强，随作用时间的延长而增强。

实施例6

采用划痕损伤实验测定AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒对HepG2细胞转移能力的影响。取用对数生长期的细胞，吹打，形成单细胞悬液，按每孔1×10⁵个细胞接种于6孔板。次日细胞贴壁后，使用无菌枪头划痕，按实施例5实验分组摄取相应纳米粒处理细胞。24h后对划痕部位拍照，如图7所示，进行图像分析。

图7划痕实验结果表明，实验组细胞经不同浓度AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒作用后的划痕宽度值明显高于对照组，提示AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒对HepG2细胞的迁移能力有抑制作用，且呈现一定的剂量依赖趋势。

实施例7

采用Transwell小室侵袭实验测定AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒对HepG2细胞侵袭能力的影响。将处于对数期生长的细胞用胰酶消化后，培养液悬浮，按每孔1×10⁵个细胞接种于6孔Transwell板中，按照实施例5的实验分组，进行纳米粒刺激24h后，进行以下操作：小室用PBS 洗两次，4%多聚甲醛固定20min；PBS洗三次，每次5min；0.1%Trition X-100透化细胞15min；PBS洗三次，每次5min；苏木素染色20min，水洗10min，待返蓝后将小室穿透膜取下，放于载玻片上，封片后镜检。随机取3个高倍镜视野，计数小室下室面细胞数， 即为穿透Matrigel的细胞数，实验结果如图8所示。

图8结果表明，实验组与未处理组和空白组相比，穿透膜细胞数呈现下降趋势，说明 AFP mAb-PLGA-rhDCN纳米粒对HepG2细胞的侵袭能力有抑制作用。