AFP单抗修饰的载DCN基因PLGA靶向纳米粒的制备及其体外活性研究

摘要

目的:
　　制备甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体修饰的载核心蛋白聚糖基因（DCN）质粒的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）靶向纳米缓释颗粒，并研究其理化特性以及对HepG2细胞抑制作用。
　　方法:
　　第一部分：
　　1.采用复乳溶剂挥发法制备靶向AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子，扫描电镜观察其形貌，激光粒度仪测定其粒径，并对不同批次的PLGA纳米粒进行包封率、载药量及体外释放率的检测；
　　2.采用羧基荧光素和罗丹明荧光素对 IgG-PLGA-rhDCN纳米粒子和AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子进行双荧光标记，分别在4h及12h时观察纳米粒进入HepG2细胞的情况；
　　3.RT-PCR鉴定AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒在HepG2细胞中的表达情况。
　　第二部分：
　　1.MTT法检测纳米粒子对HepG2细胞的增殖抑制作用；
　　2.IgG-PLGA-rhDCN纳米粒子和不同浓度的AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子作用HepG2细胞48h后，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和细胞周期；
　　3.实时荧光定量PCR检测纳米粒子作用48h后各组细胞中Bcl-2基因和caspase-3基因的表达情况。
　　结果:
　　第一部分：
　　1.复乳法制备的纳米粒子形态规则，表面平整，平均粒径为216.7±8.2nm，Zeta电位为-17.4mV；纳米粒子的包封率平均为：78.60±1.03％，载药量平均为：3.12±0.17%；纳米粒子在体外缓慢平稳释放，在240h时释放率达到79.3%；
　　2.HepG2细胞摄取实验结果显示，AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子有生物靶向作用，可在细胞中大量富集；
　　3.RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示，AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子中的DCN基因可在HepG2细胞中表达。
　　第二部分：
　　1.MTT实验中，与对照组相比，不同浓度的AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子对HepG2细胞均有显著的增殖抑制作用（p<0.05）；
　　2.流式细胞术检测结果中，实验组细胞的早期凋亡率明显高于对照组（p<0.01），且随纳米粒子浓度的升高而升高；三个实验组细胞周期的S期、G2期比例明显降低，与对照组相比差异有统计学意义（p<0.01），而G1期比例相对升高；
　　3.实时荧光定量PCR结果：Bcl-2基因在实验组中的表达随纳米粒子浓度的增高逐渐降低，而caspase-3基因则逐渐升高，与对照组相比均有统计学差异（p<0.01）。
　　结论:
　　1.成功制备了具有缓释作用的AFPmAb-PLGA-rhDCN纳米粒子，可与HepG2细胞特异性靶向结合，并且纳米粒中的DCN基因可在细胞中成功表达。
　　2.在体外，AFPmAb-PLGA–rhDCN纳米粒子可明显抑制HepG2细胞的增殖、促进其早期凋亡，且凋亡机制可能与Bcl-2和caspase-3相关。

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前言

第一部分 AFP单抗修饰的载DCN基因PLGA靶向纳米粒的制备、物理性质及靶向性检测

1 材料与方法

1.1 实验主要材料

1.2 实验方法

1.3 数据统计学处理

2 结 果

2.1 质粒酶切消化鉴定结果

2.2重组质粒中DCN基因测序结果

2.3 纳米粒子外观形态和粒径

2.4 纳米粒子的包封率及载药量

2.5 纳米粒的体外释放

2.6 纳米粒子的体外细胞主动摄取

2.7 纳米粒在HepG2细胞中的表达鉴定结果

3 讨 论

4 小 结

第二部分 AFP单抗修饰的载DCN基因PLGA靶向纳米粒对HepG2细胞抑制作用的研究

1 材料与方法

1.1 实验主要材料

1.2 实验方法

1.3 数据统计学处理

2 结 果

2.1 细胞增殖抑制实验结果

2.2 细胞凋亡率结果

2.3 细胞周期结果

2.4 实时荧光定量PCR基因表达结果

3 讨 论

4 小 结

参考文献

综述: PLGA载抗癌药物治疗肿瘤的应用

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