多糖修饰的PLGA纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究

摘要

纳米控释系统作为新型的药物载体，具有缓释、靶向、提高生物利用度，减少副作用等特点。将载体材料制成不同粒径的纳米粒子与连接适当配体作为抗肿瘤药物载体的研究成为近年来国内外一个极为重要的研究热点。本研究制备了载表阿霉素(EPI)的纳米粒，并合成了生物素化的壳聚糖(Bio—CS)，以此来修饰纳米粒，增强与肿瘤细胞的相互作用，达到靶向抗肿瘤作用，增强药物抗肿瘤效果。 ⑴选用W1/O/W2复乳法制备了载EPI的PLGA纳米粒，采用两种方法用CS修饰PLGA纳米粒表面：吸附的方法和共价交联的方法。粒径分析未修饰的PLGA纳米粒平均粒径为(248.4±21.0) nm，Zeta电势为—(21.21±2.13) mV，扫描电镜(SEM)及透射电镜(TEM)下观察其形态圆整，测定药物包封率为(84.1±3.4)％。通过X射线光电子能谱(XPS)检测到CS修饰后的纳米粒表面含有氮元素信号；红外光谱(FT—IR)证实了具有氨基特征峰，证明修饰后的纳米粒表面为CS。两种方式修饰后纳米粒表面电势为正电荷，且粒径、包封率及释药性质发生了不同程度的改变，修饰后的纳米粒药物包封率下降，但药物的释放更加平缓且突释降低，特别是共价交联方法修饰的纳米粒具有释药平缓的特点。 ⑵通过不同的投料比合成了三种不同取代度的Bio—CS，通过1HNMR以及光电子能谱(ICP)确定了Bio—CS取代度，以此通过共价交联的方式修饰PLGA纳米粒表面，考察了纳米粒的表面电势、粒径、载药量、包封率以及体外释药性质等通过XPS以及生物素试剂盒确定修饰后的纳米粒表面生物素的量。选择最优取代度的Bio—CS来进行下阶段研究。体外抑瘤效应选用Hela细胞，研究了空白纳米粒载体的细胞毒效应，载药纳米粒在4、24、48、72h时的抑瘤效应，并考察了Hela细胞在不同时间点对各种纳米粒的吞噬能力。研究结果表明纳米粒的载体材料在24h、48h的细胞活力均在90％以上，材料无明显的细胞毒效应；载药纳米粒特别是修饰后的纳米粒在48h时表现出强的杀瘤效应，连接了靶向配体生物素的纳米粒杀瘤效应更强。荧光显微镜观察细胞吞噬纳米粒的能力，并且通过流式细胞术定量检测细胞的荧光强度，实验结果表明，随着时间的延长，细胞吞噬纳米粒的量增加，24h时未修饰的纳米粒荧光强度最强，48h时Bio—CS修饰的纳米粒组细胞内荧光强度最强，通过加入过量的生物素封闭细胞表面的生物素受体，可以观察到Bio—CS修饰的纳米粒进入细胞的能力减弱。 ⑶通过小鼠体内急性及亚急性毒性实验初步评价了纳米粒的安全性，通过静脉注射给药，观察记录14d内小鼠的状态，实验组与对照组均未出现死亡，亦未出现明显的中毒体征；食量如常，体重增加亦没有明显差异，体内药动学实验选用6—8周龄180-200g雄性Wistar大鼠，静脉给药后测定不同时间点的血药浓度，药动学实验结果证实纳米粒改变了EPI在体内的药动学行为，具有良好的缓释性。Bio—CS修饰的纳米粒制剂在体内外可以达到平稳缓释EPI的效果，并具有一定的肿瘤靶向性，应用前景广阔，有望开发成一种新型抗肿瘤载体，提高生物利用度，改善疗效。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1纳米控释系统作为抗肿瘤药物载体的研究进展

1.1概况

1.2纳米靶向作用机制

1.3总结

2 PLGA微球及纳米粒表面修饰的研究进展

2.1概况

2.2修饰微球的种类

2.3总结展望

参考文献

课题的提出

课题的特点及创新点

第二章壳聚糖修饰的PLGA纳米粒的研究

1前 言

2实验方法

2.1材料与仪器

2.2 PLGA纳米粒的制备

2.3 CS修饰PLGA纳米粒

2.4粒径分析及Zeta电势

2.5纳米粒形态学检测

2.6EPI定量方法

2.7纳米粒表面化学结构的确定

2.8热分析实验

2.9纳米粒载药量检测

2.10体外释药行为

2.11统计学处理

3结果

3.1纳米粒的制备及修饰

3.2纳米粒的形态

3.3纳米粒的粒径分布及表面电势

3.4纳米粒表面结构

3.5纳米粒热力学性质

3.6纳米粒的载药量及包封率

3.7纳米粒的体外释药行为

4小结

参考文献

第三章生物素化壳聚糖修饰的PLGA纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究

1前 言

2实验方法

2.1材料与仪器

2.2Bin-CS的合成

2.3合成产物的性质表征

2.4纳米粒的制备

2.5粒径分析及表面电势

2.6纳米粒形态学观察

2.7纳米粒表面结构的确定

2.8纳米粒表面生物素量的确定

2.9纳米粒载药量检测

2.10体外释药行为

2.11统计学处理

3结果与讨论

3.1 Bio-CS的合成和表征

3.2纳米粒的形态

3.3纳米粒的粒径分布及表面电势

3.4纳米粒表面结构

3.5纳米粒表面生物素定量分析

3.6纳米粒的载药量

3.7体外释放实验

4小结

参考文献

第四章生物素化的壳聚糖修饰的PLGA纳米粒体外抗肿瘤作用研究

1前 言

2实验方法

2.1材料与仪器

2.2纳米粒的制备

2.3纳米粒性质表征

2.4细胞培养

2.5细胞生长特点

2.6细胞毒性实验

2.7荧光显微镜检测细胞摄取实验

2.8流式细胞仪检测细胞摄取实验

2.9统计学分析

3结果与讨论

3.1纳米粒性质

3.2细胞特性

3.3载体材料的体外细胞毒性实验

3.4体外抑瘤效应

3.5荧光显微镜观察细胞摄取实验

3.6流式细胞术

4小结

参考文献

第五章修饰的PLGA纳米粒的体内毒貹及药动学初步研究

1前言

2实验部分

2.1材料与仪器

2.2 EPI高效液相（HPLC）检测药物含量方法确定

2.3纳米粒的急性毒性实验

2.4药物动力学

2.6统计学分析

3结果和讨论

3.1 HPLC检测药物含量

3.2毒性实验

3.3药物动力学

4小结

参考文献

全文总结

致 谢

附：在学期间发表的论文及学术会议收录论文