黄酮类化合物对乏氧卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α表达的影响及其放射增敏作用研究

摘要

卵巢癌是困扰女性生殖系统的三大恶性实体瘤之一，其死亡率居于妇科肿瘤首位，成为女性生命健康的严重威胁。放疗是卵巢癌除手术和化疗之外的第三大治疗手段，常常作为术后辅助或姑息性疗法，但因不同组织来源的卵巢癌细胞对射线的敏感性有所不同，加之肿瘤细胞中乏氧细胞的存在，导致疗效仍然有限。肿瘤在快速生长过程中由于氧弥散障碍、血流不畅等原因导致细胞出现不同程度的乏氧情况。乏氧细胞对射线有抵抗性，严重影响放疗质量，且与肿瘤不良预后高度相关。因此，如何提高乏氧肿瘤细胞的放射敏感性成为肿瘤放射治疗学长期以来的热点课题。
　　HIF-1是哺乳动物细胞中发现的第一个缺氧应答因子，与肿瘤的放射敏感性密切相关。细胞受到辐照后HIF-1α调控的100余种基因被激活，这些基因涉及能量代谢、血管生成及细胞增殖、代谢、运动、自噬、凋亡等多个环节，使肿瘤细胞快速适应缺氧微环境，提高对射线的抵抗性。因此通过干预HIF-1α的活性可改善乏氧细胞的敏感性。
　　本研究在模拟乏氧条件下培养SKOV3细胞，以乏氧SKOV3细胞为研究对象，研究染料木黄酮、白杨素、槲皮素、灯盏花素四种黄酮类化合物对乏氧SKOV3细胞的放射增敏作用，并以已上市的天然乏氧细胞增敏剂马蔺子素为阳性对照，选择一种放射增敏作用最强的药物，探讨黄酮类化合物对HIF-1α的影响及放射增敏机制。通过这些研究为寻找乏氧肿瘤细胞放射增敏剂及肿瘤放射治疗提供新的思路和方法。具体内容如下:
　　（一）乏氧卵巢癌SKOV3细胞模型的建立及检验
　　本实验用厌氧产气袋法建立了乏氧卵巢癌SKOV3细胞模型，并用克隆形成法、MTT法、乏氧标志物法等三种方法检验了该模型的可行性。结果表明三种方法各有优缺点，但都可不同程度地证明本实验中乏氧模型的成功建立，所得结果一致。
　　（二）黄酮类化合物对常氧及乏氧SKOV3细胞的生长抑制作用
　　本实验采用MTT法检测染料木黄酮、白杨素、槲皮素、灯盏花素以及阳性对照药马蔺子素对常氧及乏氧SKOV3细胞的生长抑制作用，并筛选出无毒浓度范围。结果表明，一定浓度范围的染料木黄酮、白杨素、槲皮素、灯盏花素、马蔺子素在常氧及乏氧条件下均对SKOV3细胞存活率产生抑制作用，且呈现浓度依赖性(P＜0.05)，常氧条件下作用72h的IC50分别为47.45μg/ml,29.15μg/ml,75.98μg/ml,148.78μg/ml,38.77μg/ml,乏氧条件下作用72h的IC50分别为45.70μg/ml，24.72μg/ml，75.68μg/ml，151.46μg/ml,33.26μg/ml。
　　（三）黄酮类化合物对常氧及乏氧SKOV3细胞的放射增敏作用
　　选择无毒浓度范围内高、中、低浓度的黄酮类化合物，采用MTT法检测黄酮类化合物对常氧及乏氧SKOV3细胞放射敏感性的影响。结果表明，根据放射增敏比(SER)，四种黄酮类化合物及阳性对照药马蔺子素的放射增敏作用由强到弱依次为马蔺子素＞染料木黄酮＞白杨素＞槲皮素＞灯盏花素，其中灯盏花素基本无放射增敏作用。故选择SER最接近于马蔺子素的染料木黄酮进行放射增敏的机制研究。
　　（四）黄酮类化合物对乏氧SKOV3细胞HIF-1α表达及相关信号通路的影响
　　SKOV3细胞经过乏氧处理后，用9μg/ml染料木黄酮作用24h，接受6Gy射线照射，采用免疫荧光法和Western blot检测染料木黄酮对乏氧SKOV3细胞内HIF-1α的表达及相关信号通路的影响。Western blot结果显示乏氧可明显升高SKOV3细胞内HIF-1蛋白的水平，染料木黄酮则可抑制乏氧SKOV3细胞内HIF-1的表达，与射线联用可进一步降低HIF-1的水平，说明染料木黄酮的放射增敏作用可能与此相关。该抑制作用可能是通过抑制HIF-1上游的Ras/Raf/MEK-1/ERK1-2信号通路和/或上调介导其进入降解途径的p53蛋白的水平而实现，对上游的另一条信号通路—PI3K/Akt/mTOR通路则影响甚微。
　　（五）黄酮类化合物对乏氧SKOV3细胞放射增敏机制的研究
　　SKOV3细胞经过乏氧处理后，用3μg/ml、9μg/ml染料木黄酮作用24h，接受X射线照射，用Hoechst33342染色法检测细胞凋亡并以荧光显微镜观察，PI单染法和流式细胞术检测细胞周期分布，用免疫荧光法和Westernblot检测γ-H2AX蛋白表达来观察DSB情况。
　　结果发现，染料木黄酮单独使用或与射线联用均可提高乏氧SKOV3细胞的凋亡率，且呈现浓度依赖性(P＜0.05);对γ-H2AX蛋白进行免疫荧光染色和Western blot实验后，发现染料木黄酮可增加DNA双链断裂，抑制辐射对细胞造成的DNA损伤修复过程，以上两种效应均与染料木黄酮增强乏氧SKOV3细胞内p53蛋白的表达有关。另外，染料木黄酮还可将辐照后的乏氧SKOV3细胞阻滞在放射敏感性最高的G2/M期。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 乏氧卵巢癌SKOV3细胞模型的建立及检验

1 材料和方法

2 实验结果

2．1 克隆形成法验证乏氧模型

2．2 MTT法验证乏氧模型

2．3 乏氧标志物法验证乏氧模型

3 讨论

第二章 黄酮类化合物对常氧及乏氧SKOV3细胞的生长抑制作用

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第三章 黄酮类化合物对常氧及乏氧SKOV3细胞的放射增敏作用

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第四章 黄酮类化合物对乏氧SKOV3细胞HIF-1α表达及相关信号通路的影响

1 材料和方法

2 实验结果

2．1 染料木黄酮对处理后SKOV3细胞HIF-1α蛋白表达的影响

2．2 染料木黄酮对乏氧SKOV3细胞HIF-1α相关信号通路的影响

3 讨论

第五章 黄酮类化合物对乏氧SKOV3细胞放射增敏机制的研究

1 材料和方法

2 实验结果

2．1 染料木黄酮联合射线照射对常氧及乏氧SKOV3细胞周期的影响

2．2 染料木黄酮联合射线照射对常氧及乏氧SKOV3细胞凋亡的影响

2．3 染料木黄酮联合射线照射对常氧及乏氧SKOV3细胞DNA损伤的影响

3 讨论

结语

参考文献

综述 乏氧与肿瘤细胞放射敏感性关系的研究进展

研究生期间发表论文

致谢