水蛭多肽及抗凝机制的研究

摘要

近年来心脑血管、血栓性疾病发病率和致死率居高不下，严重威胁中老年人健康。抗凝治疗是目前应对血栓栓塞性疾病的主要措施，常用的抗凝药物如肝素、华法林等具有使血小板减少、出血、需要监测 INR等缺点。特异性凝血因子抑制剂能在发挥抗凝作用的同时有效避免出血和血小板减少等不良反应，其开发与利用已经成为新型抗凝药物的研究方向。 传统中医学认为水蛭有抗凝血、抗血栓、降血脂等功效，因而被广泛用于治疗高血压、瘀血肿痛等病症，但多年来水蛭虫体有效成分、作用机理仍不清楚。水蛭素是迄今为止发现的最强特异凝血酶抑制剂，然而目前除了水蛭素进入临床，其他水蛭提取物仍在研究中。 国内常见的水蛭药材中，日本医蛭、菲牛蛭属医蛭科（Hirudinidae），大多以动物的血液为食，为吸血水蛭；尖细金线蛭、宽体金线蛭属黄蛭科（Haemopidae），以水生昆虫及螺类为食，为非吸血水蛭[1]。目前已从欧洲医蛭[2]、日本医蛭唾液[3]中提取出水蛭素、从菲牛蛭中提取出菲牛蛭素错误!未找到引用源。，其抗凝效果良好，但水蛭素在高温条件下抗凝血活性降低甚至消失[5]。同时有研究表明宽体金线蛭、尖细金线蛭中不含水蛭素[6]；中医以水蛭干燥全体入药，又煎煮制成汤剂服用。因此推断水蛭干燥虫体中应含其他抗凝成分。 本论文采用NP-40裂解液提取、水提法、盐析-sephadex G-25凝胶柱提取、丙酮沉淀法四种方法提取水蛭虫体总蛋白，比较其优劣；利用Q TOF高分辨质谱对宽体金线蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭的蛋白质提取物进行全蛋白分子量分析；从凝血因子水平考察水蛭抗凝作用靶点，将凝血因子与水蛭总蛋白混合后进行 Native-PAGE电泳分离，采用 Western blot方法检测分离后的凝血因子FⅡa、FⅨa、FⅩa及其复合体，根据位置信息差异以直观判断活性多肽与凝血因子的相互作用。 实验结果显示： 1) NP-40裂解法所提取的总蛋白抗凝血酶活性最高，用作后续电泳样品的制备；采用水提法制备水蛭样品进行质谱实验。 2)利用Q Tof高分辨质谱解析出11种日本医蛭唾液多肽，其中含有水蛭素7349.5Da；解析出5种日本医蛭虫体多肽，成分与唾液多肽有较大差异。菲牛蛭解析出3种多肽14997.5Da、15098Da、15986.5Da。宽体金线蛭解析出4种多肽，分子量分别为3999Da、9397Da、12781.5Da、13727.5Da，其中9397Da性质稳定且丰度最高。尖细金线蛭虫体中解析出6种多肽，分子量分别为7978.5Da、9396.5Da、10701.5Da、11181.5Da，12970 Da，13715.0Da。其中9396.5 Da与宽体金线蛭抗凝成分9397 Da分子量接近。 3)采用Native-PAGE结合Western blot方法检测到宽体金线蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭总蛋白中均含有与凝血酶结合的活性多肽；且宽体金线蛭的活性抗凝多肽与凝血酶能形成不同比例结合的稳定蛋白质复合体；宽体金线蛭、尖细金线蛭中还含有与凝血因子FⅩa、FⅨa结合的活性多肽。 本论文建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性抗凝多肽-凝血因子复合物的方法研究水蛭活性抗凝多肽作用靶点，此法极大简化了活性多肽的纯化过程，相比发色底物法更为灵敏、可靠，且直观可控；应用该方法发现了宽体金线蛭、尖细金线蛭抗凝作用新靶点凝血因子 FXa、FIXa，在进一步研究中发现宽体金线蛭的活性抗凝多肽与凝血酶能形成不同比例稳定结合的蛋白质复合体。本论文研究成果为水蛭治疗血栓栓塞性疾病的临床疗效提供了现代科学依据，并为水蛭开发新的特异性凝血因子抑制剂奠定了数据基础和理论基础。

目录

声明

缩略词表

前言

第一章 水蛭唾液蛋白及水蛭虫体蛋白的提取

1.1实验材料与设备

1.2实验方法

1.3实验结果与讨论

1.4小结

第二章 水蛭多肽质谱分析

2.1实验材料与设备

2.2实验方法

2.3实验结果与讨论

2.4小结

第三章 水蛭活性多肽作用靶点分析

3.1实验材料与设备

3.2实验方法

3.3实验结果与讨论

3.4小结

结语与展望

一.结论

二.创新点

三.展望

参考文献

附录文献综述

1．水蛭药材的研究进展

2.生物质谱的应用

参考文献

致谢

硕士期间发表论文