水蛭DNA鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究

摘要

广义水蛭通常是指环节动物门(Annelida)蛭纲(Hirudinea)一类动物的总称。作为中药，从《神农本草经》开始记载使用，迄今已有3000多年的历史。中医对瘀血的定义是指体内血液停积而形成的病理产物，凡能影响血液正常运行，引血液运行不畅，致血离经脉而瘀积的内外因素，均可导致瘀血形成。中医论述水蛭的性味、功效和主治为：味咸平，可破血、逐瘀、通经，治蓄血、症瘕积聚、妇女经闭、干血成痨、跌扑损伤等证。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关。凝血是机体重要的生理防御过程，但病理性凝血即血栓形成导致血行不畅，在心脑血管疾病的恶化中起着关键的作用，因此，抗血栓和抗凝血是治疗心脑血管疾病的重要方法之一。水蛭中发现的最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素（Hirudin），水蛭素是迄今发现的最强的凝血酶抑制剂。
　　水蛭作为中药，中医临床使用历史悠久，其活血化瘀功效确切，但仍有很多中医药用的基础理论问题尚未研究清楚。如1、药用品种问题。中国药典中药水蛭的来源仅有三种，广义水蛭是环节动物门蛭纲动物的总称，有什么较好的办法能将形态类似的动物加以区分，以保证中药水蛭的品种来源及临床疗效？2、疗效药用物质基础问题。水蛭素等活性物质只能在活体的日本医蛭分泌物中提取，干燥和加热后就会受到破坏。而中医临床药用水蛭使用其干燥体，用水煎煮甚至炮制后服用，这是否还具有活血化瘀或抗凝血作用？在不吸血的宽体金线蛭中并不含水蛭素，宽体金线蛭作为中药水蛭的主流商品，是否含有抗凝血的活性物质？其抗凝血活性成分有哪些？其抗凝血作用机制与哪些因素相关？3、资源紧张问题。近年来市场需求不断上涨，中药水蛭尤其是日本医蛭的资源极度紧缺，究竟古代药用水蛭品种与现代药用品种有什么不同？什么水蛭的品种可作为新的水蛭资源品种进行替代研究？4、质量评价问题。抗凝血活性是中药水蛭活血化瘀功效的药理学基础，但目前中国药典中水蛭抗凝血活性的测定方法稳定性和准确性欠佳，期待寻找更为合理的方法用于检测水蛭药材的抗凝血活性，以确保其临床疗效。这些都是中药水蛭在临床应用中所亟待解决的中医基础理论问题。
　　为研究上述问题，本文在不同物种水蛭的分子生物学鉴定；在宽体金线蛭、日本医蛭及菲牛蛭抗凝活性成分的分析、分离及鉴定；在宽体金线蛭、日本医蛭及菲牛蛭的抗凝血体外作用机制初探；在抗凝血活性的生物检定等方面，进行了广泛而深入的研究。通过研究，发现了一些新的抗凝血活性肽及其作用机制，尤其在宽体金线蛭的研究方面，较前人有较多新的进展。
　　采用分子生物学技术，扩增得到宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、棒纹牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8个物种的ITS2、COⅠ、12SrRNA、16SrRNA等基因片断的序列，比较此4个基因片断候选序列种内种间差异；利用Wilcoxon Two Sample Tests检验，考察候选序列种间、种内变异的barcoding gap；并结合鉴定成功率，得到12SrRNA为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。并提出应用COⅠ及12SrRNA联合序列在种内保守而种间差异较大的片段设计特异引物，是准确鉴别水蛭药材真伪的理想方法。
　　采用凝胶柱色谱联合制备高效液相色谱的方法，依据中医临床的使用特点，首次从宽体金线蛭中分离得到一个耐热、具抗凝血活性的多肽成分，分子量为9374，并分析其含分子量为1832的糖链，属于糖肽类化合物，对宽体金线蛭药效物质基础有了初步的阐释。
　　用液质联用的方法，对日本医蛭及菲牛蛭中抗凝血活性多肽类成分进行了研究，分析得到日本医蛭3个多肽类成分，分子量为14998、15988、15956；菲牛蛭中分析得到6个多肽类成分，9590、13642、14998、17631、15988、16567。其中日本医蛭与菲牛蛭有两个成分具有相同的分子量，且此两成分为活性多肽部位主要的成分峰。从活性成分角度而言，菲牛蛭作为水蛭新来源是完全可以的。用胰蛋白酶酶切结合MarkerLnyx软件分析的方法，找到日本医蛭与菲牛蛭区别的特征识别肽。
　　采用体外培养结合液质联用的方法，分析了宽体金线蛭与凝血酶、凝血因子Ⅶ以及凝血因子Ⅸ的作用，初步认为宽体金线蛭抗凝血作用位点与凝血因子Ⅶ有关；对比了宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭及棒纹牛蛭与凝血酶的作用，认为后三者均与凝血酶有作用，但宽体金线蛭抗凝血作用位点是与凝血酶、凝血因子Ⅶ等多个位点相关，体现了水蛭作用多靶点整体性的特点，这一特点既符合中医整体观念，又符合中药多成分多靶点作用模式。
　　将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定，探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法。采用肝素钠作为对照品，选择APTT值作为抗凝活性评价依据，对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭的抗凝活性进行测定，测定结果分别用标准曲线法和生物检定统计法计算。4种水蛭APTT法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似，突跃范围呈平行关系，上述特点符合生物检定的要求，说明以肝素钠作为标准品，采用生物检定技术APTT法测定水蛭等样品的抗凝活性是可行的。APTT值可以全面反映水蛭的抗凝血作用，测定结果对临床使用更具指导意义。生物检定技术应用于中药质量评价，符合中医整体作用、协同作用的观点，是对现有中药质量标准控制方法良好的补充。
　　本文通过研究，整合DNA分子标记技术、LC-MS色谱联用技术、生物检定技术等现代分析手段，使用各种计算机软件系统作数据分析处理，分别从鉴定、分离、分析、质量评价等方面构建了含动物活性多肽类的中药研究的先进技术平台，为动物类中药的研究建立了一个系统研究的模式；突出了生物检测技术作为中药质量评价与控制的发展方向，采用同一APTT法评价不同活性强度不同水蛭品种的抗凝活性，解决了水蛭原有的凝血酶滴定法对不同品种测定评价方法不统一的弊端；发现菲牛蛭含有与水蛭类似的活性多肽，可考虑作为医用水蛭资源新品种，缓解水蛭资源问题等。这一系列工作将为水蛭的进一步研究奠定基础，并很好的阐述了水蛭的品种鉴定、药源替代、药效物质基础等中医药基础理论问题。

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前言

1.1 医用水蛭DNA条形码鉴定研究

1.2 宽体金线蛭抗凝血活性成分提取及结构鉴定、作用机制研究

1.3 采用统一的生物检定技术评价不同水蛭品种的抗凝血活性

第一部分 医用水蛭DNA条形码鉴定研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

REFERENCES

第二部分 宽体金线蛭抗凝血活性多肽的分离鉴定

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

REFERENCES

第三部分 日本医蛭与菲牛蛭多肽类成分分析

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

REFERENCES

第四部分 宽体金线蛭活性多肽部位抗凝血作用机理初探

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 小结和讨论

REFERENCES

第五部分 生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性测定

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨论

REFERENCE

综述——水蛭药用资源研究概况与思考

1 本草考证

2 药源品种与分布

3 炮制学研究

4 品种分类与鉴定

5 活性成分研究

6 药理作用

7 临床应用

8 分析与讨论

REFERENCE

结 语 与 展 望

附录

致谢