高产纤维素酶柄蓝状菌的基因敲除以及对CRISPR/Cas9系统的初步探究

摘要

纤维素是当今地球上组成非常丰富的碳水化合物，在植物及藻类的细胞壁中是非常重要的组成部分，它的合成降解都是地球碳循环的重要形成部分。此外随着煤炭石油等不可再生资源的枯竭，寻找利用自然中的可再生资源成为人们争相研究的热点。当代工业中用来获取纤维素酶的主要菌株之一是丝状真菌。丝状真菌柄蓝状菌EMM是一株高产纤维素酶菌株，由本实验室自主分离，是由野生菌株OPC4-1诱变而来。EMM在蛋白分泌量以及酶活稳定性方面，已达到较高的水准，但是仍不能满足工业化规模的要求。为了更高程度地提高纤维素酶的产量，并且把菌株改造成一个稳定的宿主菌株，从分子水平上分析丝状真菌产生纤维素酶及半纤维素酶的调控机制是一种行之有效的方法。本文分别从以下三个方面改造菌株：
　　①纤维素酶是诱导酶，柄蓝状菌EMM只有当胞外存在诱导物如纤维素、乳糖及槐糖等时才可以表达纤维素酶，但是纤维素酶的表达却会因为培养基中有葡萄糖的存在而受到抑制。所有控制纤维素酶转录的调控因子中，调控因子creA(carbon catabolite repressor gene)在碳阻遏代谢中的作用是非常至关重要的。从EMM中克隆出creA基因并进行了测序分析，确认所得基因为碳阻遏基因creA，分子生物学方法构建基因敲除载体PGcreA1-ApyrF-creA2，其中包含有可循环标记基因及打靶基因的两个同源臂。PEG/CaCl2原生质体转化将敲除基因盒转进尿嘧啶营养缺陷型菌株EMU6里，两次同源重组后成功分离出creA基因缺陷菌株△creA21。形态学分析显示，△creA21的菌落大小明显比对照菌株小，并且长更多的孢子。滤纸酶活显示，在含不同浓度葡萄糖的培养基中，△creA21菌株都分泌出更多的纤维素酶和木聚糖酶，同时在30g/L和40g/L的葡萄糖条件下，菌株可以在筛选平板上表现出更大的透明圈。
　　②生物体中ku蛋白的分泌可以促进NHEJ(nonhomologous end-joining)途径的发生，从而抑制了HR(Homologous Recombination)途径，因此打靶效率很低。从柄蓝状菌EMM中克隆出Ku70基因，测序分析所得基因确为Ku70基因。通过分子生物学方法，构建打靶载体PGApyrF-Ku70，载体中包含可循环标记基因和打靶基因的两个同源臂。运用PEG/CaCl2原生质体转化将打靶基因盒转进EMU6中，一次同源重组敲除掉Ku70基因后，在5-FOA(5-fluoroorotic acid)的筛选压力下发生二次同源重组从而使标记基因可循环。
　　③CRISPR/Cas9第三代人工核酸内切酶系统的初步建立。分子生物学方法构建重组质粒PCP-Cas9，表达基因盒中包括标记基因潮霉素B，纤维素酶启动子Pcbh，终止子Tcbh和Cas9基因（含GFP,Green Fluorescent Protein,黄色荧光蛋白）。PGE/CaCl2原生质体转化，在柄蓝状菌中表达Cas9，为CRISPR/Cas9多基因敲除与表达体系的建立奠定基础。

目录

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