gsdmd基因敲除巨噬细胞RAW 264.7的构建:基于CRISPR/Cas9系统

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW264.7,为研究gasderminD(GSDMD)在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型.方法 针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA),构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定,将Cas9质粒和pGL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW264.7;qPCR检测cas9的表达;嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Westernblot和测序鉴定.将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW264.7细胞共培养,Annexin V/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放水平分析细胞死亡情况.结果 qPCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW264.7-Cas9细胞(P＜0.01);PCR及测序证明pGL3-sgRNA串联载体构建成功;PCR、测序及Western blot结果表明成功构建gsdmd-/-RAW264.7细胞.Annexin V/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率(P＜0.01).结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW264.7细胞,为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础.