核盘菌AROM蛋白部分纯化及EPSP合成酶性质的研究

摘要

本实验以核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)为实验菌株,在含有不同碳源和氮源的培养基中培养核盘菌后,确定产EPSP合成酶的最适碳源和最适氮源分别为蔗糖和硝酸铵.对AROM蛋白复合体中的EPSP合成酶的酶学性质研究的实验结果表明,该酶酶促反应的最适温度为30℃,最适pH值为7.2;60℃以下相对酶活均保持在60﹪以上;在pH6.7~7.5范围内,它的活性较为稳定;单价的金属离子K+和化合物EDTA对它有一定的激活作用,而脲对它的抑制作用最明显,其次是Mg<'2+>和Mn<'2+>;约12.346μmol/L的草甘膦就可以抑制50﹪的酶活性.动力学分析表明这种EPSP合成酶的两种底物在低浓度时符合米氏动力学,而在高浓度情况下对酶活性有一定的抑制作用;作图法初步鉴定该EPSP合成酶的反应机制为序列机制;Hill作图表明它是一种具有负协同效应的别构酶,因此求得的动力学常数均为表观常数,其中K<,m>(PEP)为140.28μmol/L,K<,m>(S3P)为138.89μmol/L;草甘膦对于底物PEP是竞争性抑制剂,其表观抑制常数K<,i>(GLP对PEP)为0.322μmol/L,而对于另一种底物S3P则表现为没有抑制作用;该EPSP合成酶受温度的影响较大,在未反应情况下的失活活化能为408.16kJ/mol.

目录

文摘

英文文摘

第1章绪论

1.1研究背景

1.1.1生物体内芳香族氨基酸的合成

1.1.2除草剂草甘膦的特性及其作用机理

1.1.3蛋白质提纯工艺

1.1.4 EPSP合成酶的研究意义

1.2国内外研究现状

1.2.1 EPSP合成酶及其编码基因的确定

1.2.2 EPSP合成酶的分类

1.2 3 EPSP合成酶的定位

1.2 4 EPSP合成酶的理化性质

1 2 5 EPSP合成酶的三维结构及其活性区

1.2 6 EPSP合成酶的催化机制

1.2 7草甘膦对EPSP合成酶的抑制机理

1.2.8 EPSP合成酶的分子生物学研究

1.2 9 EPSP合成酶提取纯化的研究现状

1.3 EPSP合成酶研究趋向

1.4本课题研究的目的和意义

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2培养基

2.1.3实验药品

2.1.4主要仪器

2.1.5缓冲液和常用试剂的配制

2.2实验方法

2.2.1菌种活化和扩大培养

2.2.2莽草酸的检测

2.2.3莽草酸-3-磷酸的制备

2.2.4孔雀绿显色反应无机磷标准曲线的绘制

2.2.5粗酶液的制备

2.2.6核盘菌产EPSP合成酶的最适碳源和最适氮源的选择

2.2.7 DEAE Cellulose DE-52离子交换层析

2.2.8 Sephadex G-200分子筛(凝胶过滤)层析

2.2.9蛋白质浓度的考马斯亮蓝染色测定

2.2.10 SDS-PAGE

2.2.11 EPSP合成酶最适温度及温度稳定性的测定

2.2.12 EPSP合成酶最适pH值及pH值稳定性的测定

2.2.13金属离子和化合物对EPSP合成酶酶活的影响

2.2.14草甘膦对EPSP酶活性的抑制作用

2.2.15底物PEP和S3P对酶活性的影响

2.2.16酶促反应机制的初步鉴定及动力学常数的测定

2.2.17 EPSP合成酶是否为别构酶的判别

2.2.18草甘膦对EPSP合成酶抑制常数Ki(草甘膦)的测定

2.2.19 EPSP合成酶的失活活化能的测定

2.2.20 K+对EPSP合成酶Km的影响

2.2.21 K+对草甘膦对EPSP合成酶的抑制常数Ki(草甘膦)的影响

2.3本章小结

第3章实验结果

3.1莽草酸-3-磷酸的制备

3.2无机磷标准曲线的绘制

3.3蛋白质浓度标准曲线的绘制

3.4核盘菌产EPSP合成酶的最适碳源和最适氮源的选择

3.5 DEAE Cellulose DE-52离子交换层析

3.6 Sephadex G-200分子筛(凝胶过滤)层析

3.7 EPSP合成酶最适反应温度及温度稳定性的测定

3.8 EPSP合成酶最适反应pH值及pH值稳定性的测定

3.9某些金属离子和化合物对EPSP合成酶活性的影响

3.10草甘膦对EPSP合成酶活性的影响

3.11 EPSP合成酶的底物PEP和S3P对酶活性的影响

3.12 EPSP合成酶反应机制的初步鉴定和动力学常数的测定

3.13 EPSP合成酶是否为别构酶的判别

3.14草甘膦对EPSP合成酶抑制常数Ki的测定

3.15 EPSP合成酶的失活活化能的测定

3.16 K+对EPSP合成酶Km'的影响

3.17 K+对草甘膦对EPSP合成酶的抑制常数Ki(PEP)的影响

3.18本章小结

第4章讨论

4.1 AROM蛋白的提取纯化

4.2 EPSP合成酶的酶学性质

4.3 EPSP合成酶的动力学性质

4.4本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

致谢