茶树多酚氧化酶的提取、分离纯化及其部分酶性质研究

摘要

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)对茶树的生理代谢和生产加工都有着极为重要的作用，然而目前缺少对茶树PPO单一同工酶的研究。本课题以绿茶适制性最好的龙井43号茶树品种为材料，通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析，分离纯化得到三种PPO单一同工酶，并对PPOⅠ、PPOⅢ的酶学特性进行了研究。主要研究结果如下:
　　(1)以龙井43号茶鲜叶为材料，在不同的单因素条件下提取粗酶液，通过测定粗酶活性和非变性凝胶电泳比较同工酶条带等，确定PPO粗酶提取的最佳条件。结果表明，以料液比1∶2，加入内含5％PVP(w/v)经预冷的pH7.2柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.15mol/L)，冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤制得的PPO粗酶液活性最高，出现5条明显的同工酶带。
　　(2)最佳提取条件得到的PPO粗酶，经优化确定以30％-80％的硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白，沉淀经超滤脱盐浓缩，再经过DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Sephndex G-150凝胶过滤层析纯化得到三条电泳纯的PPO单一同工酶(PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ)。PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ的大小分别为38kDa、48kDa和80kDa，分别被纯化14.41、1.08和1.30倍，比活力为7177.0U/mg、537.45U/mg和648.22U/mg。
　　(3)酶学特性研究表明，PPOⅠ的最适pH为5.6，PPOⅢ的最适pH为6.8，二者在pH5.6-7.2的范围内均能保持60％以上的相对酶活。PPOⅠ、PPOⅢ的最适温度分别为30℃和35℃，25℃-40℃的温度范围内，二者活性均较高;温度超过60℃时，二者基本失活。亚硫酸钠、半胱氨酸、抗坏血酸均对PPOⅠ、PPOⅢ有抑制作用，半胱氨酸抑制效果相对较好，低浓度的Cu2+对PPOⅠ、PPOⅢ的活性有促进作用。以邻苯二酚为底物时，PPOⅢ对底物的亲和力要强于PPOⅠ。PPOⅠ的Km值为91.34mmol/L，PPOⅢ的Km值为51.65mmol/L。

目录

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摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 茶树PPO的提取与纯化

1．1 PPO的提取

1．2 PPO的分离纯化

2 茶树PPO的生化性质研究进展

2．1 PPO同工酶的研究

2．2 PPO酶学性质研究进展

3 茶树PPO分子生物学研究进展

3．1 PPO的蛋白结构

3．2 PPO的基因结构与基因克隆

4 茶树PPO的应用研究

4．1 PPO在茶叶加工中的应用

4．2 外源PPO在茶叶中的应用

4．3 茶树PPO的其它应用

5 研究目的与意义

第二章 茶树PPO的提取

1 材料方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果分析

2．1 添加剂种类对茶树PPO提取的影响

2．2 PVP添加量对茶树PPO提取的影响

2．3 料液比对茶树PPO提取的影响

2．4 浸提时间对茶树PPO提取的影响

2．5 pH对茶树PPO提取的影响

3 讨论

4 结论

第三章 茶树PPO同工酶的分离纯化

1 材料方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 茶树PPO硫酸铵分级沉淀结果

2．2 茶树PPO离子交换层析结果

2．3 茶树PPO凝胶过滤层析结果

3 讨论

3．1 茶树PPO分离纯化的盐析过程

3．2 茶树PPO分离纯化的柱层析过程

3．3 茶树PPO同工酶的分子量

4 结论

第四章 茶树PPO酶学性质分析

1 材料方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果分析

2．1 温度对茶树PPO酶活性的影响

2．2 pH对茶树PPO酶活性的影响

2．3 抑制剂对茶树PPO酶活性的影响

2．4 Cu2+对茶树PPO酶活性的影响

2．5 茶树PPO酶动力学实验

3 讨论

3．1 茶树PPO反应的最适条件

3．2 茶树PPO的酶活性抑制

4 结论

参考文献

致谢