红松松仁抗氧化肽与抗肿瘤肽的制备及功能鉴定

摘要

红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc)，是主产于中国小兴安岭的珍贵树种。红松松仁是一种营养价值很高的果品，富含蛋白质，是制备功能活性肽的良好蛋白质源。本文以红松松仁蛋白为原料，对其蛋白酶解工艺、抗氧化及抗肿瘤活性、分离及结构组成进行了研究。
　　采用蛋白酶水解法制备松仁抗氧化肽，以总还原力为指标，响应面分析法优化酶解工艺，得到松仁抗氧化肽的最佳酶解工艺条件为：pH8.5，酶与底物比6250U/g蛋白，底物浓度0.6％，反应温度51℃，酶解时间120min。在该水解条件下，松仁抗氧化肽的总还原力A700达到0.652。为了探讨松仁抗氧化肽的体外抗氧化作用，以VC为对照研究了其总还原能力、对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2－·)、ABTS自由基的清除能力。结果表明，浓度为20mg/mL的松仁抗氧化肽的还原能力达到相同浓度Vc的84.3%，对·OH、O2－·和ABTS自由基的清除率分别为96.91%、58.59%、100%。通过体内试验研究了松仁抗氧化肽对辐射引起的氧化伤害的修复作用。结果表明，松仁抗氧化肽对小鼠体重影响不显著，但可使脾指数及肝指数升高，显著提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活力，降低氧化酶系即一氧化氮合酶（NOS）和黄嘌呤氧化酶（XOD）的活力，降低过氧化产物丙二醛（MDA）的含量。
　　采用蛋白酶水解法制备松仁抗肿瘤肽，以水解度为指标，响应面分析法优化酶解工艺，得到松仁抗肿瘤肽的最佳酶解工艺条件为：pH9.0，酶与底物比6000U/g蛋白，底物浓度0.6%，反应温度55℃。在该水解条件下得到水解度为50%的多肽抗肿瘤效果最强。采用MTT法测定松仁抗氧化肽体外抗肿瘤活性，结果显示松仁多肽可抑制HT29人结肠癌细胞、HepG2人肝癌细胞癌细胞增殖，具有抗癌功能。其IC50值分别为0.475mg/mL、0.825mg/mL。
　　松仁抗氧化肽、抗肿瘤肽经过Sephadex G-50、Sephadex G-25凝胶过滤层析两次分离得到抗氧化活性最强的组分 PAⅢ-c及抗肿瘤活性最强的组分PCⅡ-c。将PAⅢ-c组分和PCⅡ-c组分采用高效液相色谱进行分子量分布测定，结果表明 PAⅢ-c组分的分子量主要集中在300～1000Da，PCⅢ-c组分的分子量主要集中在250～500Da。测定PAⅢ-c组分、PCⅡ-c组分氨基酸组成，结果表明抗氧化肽PAⅢ-c组分其疏水性氨基酸含量较高，占总氨基酸含量的30%，这可能是其具有抗氧化功能的主要原因。

目录

红松松仁抗氧化肽与抗肿瘤肽的制备及功能鉴定

The preparation and function ofantioxidative peptides and antitumorpeptides from Korean pine nuts

摘 要

Abstract

第1 章 绪论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 红松松仁的研究现状

1.3 生物活性肽的研究现状

1.4 抗氧化肽的研究概况

1.5 抗肿瘤多肽的研究概况

1.6 课题主要研究内容

第2 章 材料与方法

2.1 实验试剂及材料

2.2 实验仪器及设备

2.3 测定方法

2.4 松仁活性肽的制备工艺

2.5 松仁活性肽抗氧化及抗肿瘤功能研究

2.6 松仁活性肽的分离及结构分析

第3 章 松仁抗氧化肽及抗肿瘤肽制备工艺研究

3.1 肽键法测定多肽含量的标准曲线

3.2 松仁抗氧化肽酶解蛋白酶的筛选

3.3 松仁抗氧化肽酶解工艺单因素条件的确定

3.4 松仁抗氧化肽酶解工艺的响应面分析

3.5 松仁抗肿瘤肽酶解蛋白酶的筛选

3.6 松仁抗肿瘤肽酶解工艺单因素条件的确定

3.7 松仁抗肿瘤肽酶解工艺的响应面分析

3.8 本章小结

第4 章 松仁活性肽抗氧化及抗肿瘤功能研究

4.1 松仁抗氧化肽总还原能力测定

4.2 松仁抗氧化肽对羟自由基清除能力测定

4.3 松仁抗氧化肽对超氧阴离子清除能力测定

4.4 松仁抗氧化肽对ABTS 自由基清除能力测定

4.5 松仁抗氧化肽对辐射引起的氧化伤害的修复能力测定

4.6 松仁抗肿瘤肽对肿瘤细胞增殖的影响

4.7 本章小结

第5 章 松仁活性肽的分离及结构分析

5.1 松仁抗氧化肽的分离及活性跟踪

5.2 松仁抗肿瘤肽的分离及活性跟踪

5.3 松仁活性肽相对分子量的测定

5.4 松仁活性肽氨基酸组成的测定

5.5 本章小结

结 论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

致 谢