玉米幼苗中谷氨酰胺转氨酶的分离纯化及其性质研究

摘要

谷氨酰胺转氨酶（TGase）是一种催化酰基转移反应的酶，它广泛存在于动植物组织器官和多种微生物中。动物来源的 TGase含量少，纯化工艺复杂，且是 Ca2+依赖型，难以得到大规模应用。目前，微生物来源的 TGase是研究和应用最多的。然而植物来源的 TGase目前报道较少。本研究拟从黄化的玉米叶中纯化得到谷氨酰胺转氨酶、研究其酶学性质、考察 TGase在酸奶产品中的应用特性，同时与微生物来源的 TGase进行性质比较，进而探索玉米来源的 TGase应用于商业化生产中的可行性。
　　首先，以黄化的玉米叶为原料，通过破碎、萃取、超滤浓缩、凝胶过滤层析等步骤分离纯化得到一定纯度的谷氨酰胺转氨酶。在纯化过程中对离心、超滤、凝胶过滤层析中的条件进行了优化。通过优化的条件进行 TGase分离，得到的TGase比酶活为27.28 U/g，酶活回收率为13.84％，纯度为3.0%，分子量约为61 kDa。
　　然后，以纯化的玉米 TGase为样品，考察了温度和 pH值对 TGase活性的影响。研究结果表明：玉米 TGase的最适温度为35℃，在30~45℃范围内具有较高酶活性；玉米 TGase的最适 pH为9.0，在 pH8.0左右时酶活最为稳定，在 pH8.0~9.0的范围内具有较高酶活性。另外，通过差示扫描量热法研究其热变性温度，结果表明玉米 TGase变性起始温度是46.03℃，相变温度为60.50℃。
　　本研究将玉米 TGase和微生物 TGase在酸奶发酵前加入到全脂牛乳中,发现加TGase的酸奶产品在坚实度和稠度上明显高于对照组；加玉米 TGase的酸奶在粘度和粘滞指数上却低于加微生物 TGase酸奶和对照组酸奶。从表观形态上看，添加 TGase的酸奶都出现了明显颗粒状凝块。
　　综合本研究结果来看，玉米 TGase在温度稳定性方面好于微生物 TGase，而在 pH值稳定性方面则不如微生物 TGase。因此，玉米 TGase可以应用在一些对温度要求较严格的食品中，而在某些 pH值较低的食品中的应用具有一定的局限性。整体上看，玉米 TGase作为一种促使蛋白质交联的催化剂，具有一定的应用潜力。

目录

玉米幼苗中谷氨酰胺转氨酶的分离纯化及其性质研究

PURIFICATION AND PROPERTIES OF TRANSGLUTAMINASE FROM MAIZE LEAVES

摘 要

Abstract

目 录

第1章 绪论

1.1 立题背景

1.2 谷氨酰胺转氨酶的研究现状

1.2.1 谷氨酰胺转氨酶的催化作用机理

1.2.2 酶活性测定方法研究进展

1.2.3 谷氨酰胺转氨酶的分布

1.2.4 谷氨酰胺转氨酶分离纯化研究进展

1.2.5 谷氨酰胺转氨酶的性质比较

1.2.6 谷氨酰胺转氨酶在食品中的应用

1.3 本课题研究的目的及意义

1.4 本课题主要研究内容

第2章 材料与方法

2.1 实验原料

2.2 药品与设备

2.2.1主要药品与试剂

2.2.2 主要仪器及设备

2.3 实验方法

2.3.1 SDS-PAGE

2.3.2 酶活测定方法优化

2.3.3 MLTG的分离纯化方法优化

2.3.4 MLTG的性质研究

2.3.5 MLTG在酸奶产品中的应用研究

2.3.6 其他分析测定方法

2.3.7 数据处理方法

第3章 玉米谷氨酰胺转氨酶的分离纯化

3.1 玉米叶水分及蛋白质含量

3.1.1 湿玉米叶水分含量

3.1.2 湿玉米叶全蛋白质含量

3.2 酶活测定方法优化

3.2.1 MLTG溶液的最大光吸收波长确定

3.2.2 氧肟酸比色法测酶活的条件优化

3.3 离心条件对酶的影响

3.3.1 离心转速与粗酶液中蛋白质含量和酶活的关系

3.3.2 离心时间与粗酶液中蛋白质含量和酶活的关系

3.4 超滤条件对酶的影响

3.4.1 浓缩倍数与超滤时间之间的关系

3.4.2 浓缩倍数对比酶活的影响

3.5 凝胶过滤层析条件的确定

3.5.1 上样量对酶纯化效果的影响

3.5.2 洗脱速度对纯化效果的影响

3.6 MLTG纯度测定

3.7 酶的分离纯化汇总

3.8 本章小结

第4 章 玉米谷氨酰胺转氨酶的酶活稳定性研究

4.1 酶的最适温度

4.2 热处理对酶活稳定性的影响

4.2.1 热处理时间对酶活稳定性的影响

4.2.2 热处理温度对酶活稳定性的影响

4.2.3 DSC 测定蛋白质变性温度

4.3 酶的最适pH

4.4 酶的pH 稳定性

4.5 低温（4℃）条件下酶溶液的酶活变化

4.6 本章小结

第5章 玉米谷氨酰胺转氨酶的应用特性研究

5.1 TGase对不同底物蛋白的交联作用研究

5.1.1两种来源TGase对酪蛋白的交联作用

5.1.2两种来源TGase对牛乳乳清蛋白的交联作用

5.1.3两种来源TGase对大豆分离蛋白的交联作用

5.2 两种TGase对酸奶品质的影响

5.2.1 酸奶样品的制备

5.2.2 质构测定

5.3 本章小结

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

附 录

附录一 L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线的绘制

附录二 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明

致 谢