红豆越橘多酚对氧化诱导损伤及癌细胞增殖抑制作用研究

摘要

自由基医学研究表明自由基引发的氧化损伤与人类近百余种疾病密切相关,因此评价和筛选具有强抗氧化活性的天然产物成分已成为医学、生物学和食品科学研究的新趋势。本论文选取红豆越橘为研究对象,采用活性跟踪的方法,获得了活性最强的红豆越橘多酚(LBP),并对其主要成分进行分析鉴定。系统的分析了LBP的体外抗氧化活性,对辐射诱导机体损伤的防护作用及对肿瘤细胞增殖的抑制活性,并对抗氧化活性和抗癌细胞增殖活性进行了相关性分析。结果显示,LBP具有较强的抗氧化和抗癌细胞增殖活性且具有良好的相关性,说明浆果中天然存在的植物化合物的联合作用在抗氧化以及肿瘤预防方面至关重要。
　　采用活性跟踪的方法分离纯化野生红豆越橘,首先用80％丙酮冷冻提取游离型酚类和类黄酮,浓缩后用大孔吸附树脂X-5富集分离红豆越橘多酚,多酚含量和ABTS抗氧化做指标确定乙醇梯度洗脱有效组分,并命名为LB-1,LB-2,LB-3,LB-4,其总洗脱物命名为LB-MIX(LBP)。用MTS法检测以上5个组分抗结肠癌HT29、卵巢癌Hela、肺癌A549和肝癌HepG-2细胞增殖活性,结果显示,LBP具有较好的抑制几株癌细胞的增殖活性。选取抗癌活性较强的顺铂为阳性对照。为了鉴定此纯化物的化学组成,本实验采用UPLC-ESI-MS联用的方法定性分析红豆越橘多酚的组成成分。结果显示,其主要成分有9种花色苷,4种原花青素和5种酚酸。
　　系统的研究了LBP的体外抗氧化活性作用。如清除生理自由基、非生理自由基、还原能力、螯合能力、抗脂质过氧化能力和辐射诱导氧化损伤的防护能力等,结果显示,LBP具有较高的抗氧化活性,并呈良好的剂量效应关系,其氧化能力略低于或与抗氧化剂抗坏血酸相当。并具有较高的金属离子螯合能力和还原能力,对于脂质过氧化和辐射诱导的氧化损伤具有一定的保护。比较了10种浆果与红豆越橘的多酚、黄酮和花色苷含量,不同浆果中多酚、黄酮、花色苷含量差异性显著(p<0.01)。红豆越橘的多酚、黄酮和花色苷含量在11果中排前4位,同时对ABTS+?和DPPH?的清除活性也居于前列。
　　构建了辐射诱导的氧化损伤模型,实验表明,LBP各剂量组可有效的促进造血和免疫细胞增殖和生长,能够明显的提高小鼠各脏器中超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活性,乳酸脱氢酶(LDH)活性和增加还原型谷胱甘肽(GSH)的含量,降低髓过氧化物酶(POM)活性,减少丙二醛(MDA)含量,能够有效的激活抗氧化酶系,抑制氧化酶系,减少脂质过氧化,保护细胞膜的损伤,减少微核和染色体畸变率,细胞周期分布显示与模型组比较,LBP加药组使阻滞于G0/G1期的细胞减少而S期和G2/M期细胞增多,呈极显著性差异(p<0.01),细胞增殖能力得到恢复。单细胞凝胶电泳显示辐射前灌胃LBP,可以有效的较少DNA的损伤,使彗星尾长度明显减少。透射电镜再一次证明LBP对脾组织和肠绒毛的保护作用。
　　研究了LBP对癌细胞的增殖抑制活性,结果显示,11种浆果中红豆越橘对HT29和HepG2两种癌细胞的抑制活性最强,蓝靛果对癌细胞的抑制活性较弱,11种浆果对癌细胞的抑制活性与其多酚含量没有显著的相关性。进一步采用琼脂糖凝胶电泳验证了LBP可以使细胞膜损伤产生DNA-Ladder碎片,同时用流式细胞仪对LBP及顺铂作用后的几种癌细胞进行了细胞周期分析,用单细胞凝胶电泳验证了提取物对癌细胞的DNA损伤程度。结果显示,红豆越橘多酚可以从不同角度诱导细胞凋亡。建立了体外抗氧化和抗癌细胞增殖的相关性,揭示了抗氧化剂的抗氧化、清除ROS作用与其防癌抑癌作用之间存在关联,进一步证实了红豆越橘多酚具有较好的功能活性,对于揭示浆果多酚预防由自由基引发的氧化损伤的作用机制以及开发研制新型抗癌药物具有重要的理论和实际意义。

目录

红豆越橘多酚对氧化诱导损伤及癌细胞增殖抑制作用研究

EFFECT OF POLYPHENOL IN LINGONBERRY ON DAMAGE INDUCED BY OXIDATION AND ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITIES OF CANCER CELL

摘 要

Abstract

目 录

Contents

第1章 绪 论

1.1 研究背景及目的和意义

1.2 自由基与氧化损伤

1.3 天然自由基清除剂

1.4 氧化诱导损伤的产生机制和防御机制

1.5 主要研究内容

第2章 实验的材料与方法

2.1 实验材料与仪器设备

2.2 红豆越橘多酚的提取纯化鉴定方法

2.3 抗氧化活性测定方法

2.4 抗氧化成分测定方法

2.5 动物实验

2.6 细胞实验

2.7 统计分析方法

第3章 活性跟踪法确定最优组分并鉴定主要成分

3.1 引言

3.2 大孔树脂富集红豆越橘多酚

3.3 对癌细胞增殖活性抑制筛选最优组分

3.4 红豆越橘多酚（LBP）的主要成分确定

3.5 本章小结

第4章 红豆越橘多酚抗氧化活性及抗氧化成分分析

4.1 红豆越橘多酚清除生理自由基

4.2 红豆越橘多酚还原能力及螯合能力

4.3 抗脂质过氧化作用

4.4 红豆越橘多酚对辐射诱导白细胞损伤的防护效应

4.5 比较红豆越橘与其他浆果的抗氧化成分和活性

4.6 本章小结

第5章 红豆越橘多酚对辐射诱导氧化损伤的防护作用

5.1 引言

5.2 红豆越橘多酚对体重及其血象的影响

5.3 LBP对特异性免疫和非特异性免疫的影响

5.4 红豆越橘多酚对体内相关氧化酶活力的影响

5.5 红豆越橘多酚对骨髓细胞微核数的影响

5.6 红豆越橘多酚对骨髓染色体畸变的影响

5.7 红豆越橘多酚对脾细胞周期的影响

5.8 红豆越橘多酚对小鼠脾细胞DNA损伤的影响

5.9 小鼠脾细胞和肠绒毛超微组织形态学观察

5.10 相关性分析

5.11 本章小结

第6章 红豆越橘多酚抗细胞增殖活性研究

6.1 引言

6.2 抗癌细胞增殖活性分析

6.3 多酚类化合物与抗氧化、抗癌细胞增殖相关性分析

6.4 倒置显微镜下细胞形态学观察

6.5 琼脂糖凝胶电泳梯状DNA检测细胞凋亡

6.6 LBP对肿瘤细胞周期分布的影响

6.7 LBP对肿瘤细胞DNA损伤的影响

6.8 LBP抗氧化和抗癌细胞增殖相关性分析

6.9 LBP抗肝癌细胞增殖和对细胞DNA损伤相关性分析

6.10 LBP抗肝癌细胞增殖和细胞周期阻滞相关性分析

6.11 本章小结

结 论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文及其他成果

哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学博士学位论文使用授权书

致 谢

个人简历