花生种子中内生细菌的筛选鉴定及种群多样性分析

摘要

花生黄曲霉毒素污染不仅危害人类健康,同时引起国际贸易纠纷,成为世界各国共同关注的问题之一。本研究利用产生红色物质 Norsolorinic acid(NA)寄生曲霉突变株NFRI-95作为指示菌株,采用平板对峙法和tip culture法从花生种子中筛选出具有抗黄曲霉毒素活性的内生菌株,为防治花生黄曲霉毒素污染提供丰富的菌种资源和基因资源。
　　本试验对不同省份不同品种的花生种子内生菌进行分离,共得到285株内生细菌,利用平板对峙方法对541株内生细菌进行抑菌抑毒活性初筛,结果表明,65.6％的抑菌菌株和36.1%的抑毒菌株在PGY培养基上表现出的抑制寄生曲霉NFRI-95菌丝体生长和抑制红色物质NA产生的能力比在GY培养基上的效果显著;Tip culture试验检测花生种子内生细菌发酵上清对寄生曲霉NFRI-95菌丝体及 NA产生的抑制效果,其中5株内生细菌的发酵液能够完全抑制菌丝体的生长,86株能够完全抑制红色物质NA的产生,68.53%的菌株发酵液的菌丝体生长抑制率在80%以上，80.20%的菌株发酵液的NA抑制率在80%以上;之后选取 tip culture试验中菌丝体抑制率在95%以上的菌株,分析其发酵液pH值和OD600值对菌丝体抑制率和NA产生抑制率的影响,结果表明,具有较高生物活性的内生菌株发酵液多数呈酸性(pH<7.0),且集中在pH值6.0～6.5范围内,说明代谢产物呈酸性的内生细菌在抑制寄生曲霉突变株菌丝体生长及红色物质 NA产生方面有更大的应用潜力,而 OD600值较为稳定,波动范围较小,基本处于1.5～2.0之间,表明内生细菌的生长量对菌丝体抑制率和NA产生抑制率的影响较小。
　　本试验对复筛结果中发酵液拮抗活性较高的133株内生细菌进行鉴定,形态学试验结果表明,66.92%的内生细菌为革兰氏阳性菌,32.08%为革兰氏阴性菌,菌株个体形态为杆状或短杆状。16SrDNA序列分析结果表明,133株内生细菌属于12个类群,其中与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)属于一个类群的内生菌共有47株,与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)属于一个类群的有36株,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亲缘关系较近的有13株,与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)亲缘关系较近的11株,与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)亲缘关系近的有6株,与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)亲缘关系较近的有10株,与粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)亲缘关系近的有3株,与洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)亲缘关系近的有2株,而与多粘芽孢杆菌( Paenibacillus polymyxa)、寡养单胞菌( Stenotrophomonas pavanii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和无色菌属(Achromobacter sp.)亲缘关系近的仅1株;66.17%的内生细菌与芽孢杆菌属亲缘关系紧密,成为优势菌属。
　　本文利用可视化平板对峙法及 tip culture法筛选具有抗黄曲霉毒素生物活性的花生种子内生细菌,不仅为黄曲霉毒素生防细菌的研究提供丰富的菌株资源,也为防治黄曲霉毒素田间污染花生奠定理论基础。

目录

花生种子中内生细菌的筛选鉴定及种群多样性分析

SCREENING AND IDENTIFIACATION OF ENDOPHYTIC BACTERIA ISOLATED FROM PEANUT SEEDS AND POPULATION DIVERSITY ANALYSIS

摘 要

Abstract

第1章 绪 论

1.1 课题背景

1.2 课题研究现状

1.3 课题来源和研究内容目的

第2章 不同省份花生种子中内生菌的分离纯化

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

第3章 抗黄曲霉毒素活性菌株的筛选

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 本章小结

第4章 活性菌株的鉴定及种群多样性分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 本章小结

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

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致 谢