花生油脂代谢关键基因在酵母和聚球藻中表达及功能验证

摘要

花生是世界第四大油料作物，被广泛种植，是重要的植物油来源。植物油脂是植物油的主要成分，其中很多脂肪酸具有重要的营养保健和医疗价值。我国花生大部分品种脂肪酸的油酸/亚油酸比值低，这直接影响花生的贮存和货架时间，也是我国花生国际竞争力低的直接原因。提高油料作物的含油量和油酸的相对含量，增加油酸/亚油酸（O/L）的比值，已成为油料作物育种的主要目标。本论文分析了不同花生品种（系）的油脂含量和脂肪酸组成，这将有助于了解不同花生品种（系）的品质特性，便于选育耐贮性好、营养健康的油用型和食用型花生专用品种。本论文克隆获得了花生油脂和脂肪酸合成代谢途径的关键基因AhDGAT1-1、AhDGAT1-2、AhDGAT3-3和AhFAD6，分析了这四个基因在花生不同组织器官、不同种子发育时期以及逆境胁迫条件下的表达差异；通过构建表达载体分别转化酿酒酵母S.cerevisiae和聚球藻Synechocysti sp.PCC7962对基因的功能进行了验证。为深入解析这4个基因在花生油脂和脂肪酸合成代谢和逆境胁迫应答反应中的作用机制提供基础。这将为改良花生品质提供新的方向，同时为花生抗性分子调控研究提供新的基因资源。
　　1、对花生总脂含量和脂肪酸组成的研究：（1）不同花生品种（系）总脂含量和脂肪酸组成的研究：对15个花生品种（系）的油脂含量和脂肪酸成分进行了分析，发现各花生品种（系）的油脂含量差异不大，河北高油的油脂含量最高，为53.97％；品系E12的油脂含量仅低于河北高油0.19%。油酸和亚油酸为花生种子中的主要脂肪酸成分，其中油酸的含量较亚油酸含量高。（2）花生种子发育过程中油脂和脂肪酸累积模式研究：对4个品种（系）：花育19、E18、E11和鲁花6号的油脂和脂肪酸含量的变化进行分析发现，在种子发育过程中总油脂含量均持续增长，随着油脂含量的提高，硬脂酸含量逐渐升高，棕榈酸含量逐渐降低。油酸和亚油酸的相对含量变化规律相反。
　　2、通过qRT-PCR的方法明确了AhFAD6、AhDGAT1-1、AhDGAT1-2、AhDGAT3-3基因在不同组织器官、不同种子发育时期以及逆境胁迫条件下的表达差异。发现AhFAD6基因在叶片中的表达量明显高于其它组织，在种子发育过程中AhFAD6基因表达呈现下降的趋势；AhDGAT1-1基因在花和种子中的表达量明显高于其他组织，AhDGAT1-2基因在根、子叶和种子中的表达量相近且高于其他组织；AhDGAT3-3基因在花中的表达量较高，其次是叶，但在其他组织中的表达量相差不大。AhDGAT1-1基因在种子发育过程中表达量呈先上升后下降趋势；AhDGAT1-2基因在果针入土10天和60天时具有较高的表达水平；AhDGAT3-3基因在果针入土20天和50天时表达量较高。AhFAD6、AhDGAT1-1、AhDGAT1-2、AhDGAT3-3基因受各种非生物胁迫诱导表达呈现不同程度的上调，最高为处理前的12倍。这4个基因在花生对低温、高盐或干旱等胁迫的适应中可能有积极的作用。
　　3、Δ12脂肪酸去饱和酶（Δ12 fatty acid desaturase，Δ12 FAD）催化油酸和棕榈油酸生成亚油酸和棕榈二烯酸。本论文利用搜索获得的拟南芥和大豆中的脂肪酸去饱和酶基因序列，搜索花生EST。获得花生Δ12脂肪酸去饱和酶基因（AhFAD6）全长基因，将AhFAD6基因转化聚球藻，聚球藻PCC7942是一个优良的光自养模式蓝藻，它只含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，因此可以用来验证叶绿体型Δ12脂肪酸去饱和酶的功能。结果发现：AhFAD6基因编码具有酶活性的蛋白，能够以油酸为底物合成亚油酸。
　　4、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）的作用是催化二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油，它是生物体内TAG合成过的最后一步反应的酶，是甘油三酯合成过程中的关键酶和限速酶。本论文成功克隆了3个花生DGAT基因（AhDGAT1-1、AhDGAT1-2、AhDGAT3-3），通过构建花生DGAT基因的表达载体转化酿酒酵母TAG合成缺陷株H1246中，并且利用荧光染料对转化酵母细胞染色，结果显示：AhDGAT1-1、AhDGAT1-2和AhDGAT3-3基因能使酵母转化株的细胞重现油滴，三个DGAT基因在酿酒酵母中的表达恢复了H1246油体缺陷的表型，使得H1246中TAG的合成和累积得到了恢复，表明克隆所得的基因编码具DGAT酶活性的蛋白；利用气质联用（GC-MS）方法分析转基因酵母脂肪酸组分含量，对比阳性与阴性对照菌株，分析脂肪酸组分的含量变化，进一步探究TAG与脂肪酸合成的分子机制。

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第1章 绪 论

1.1 课题来源及目的意义

1.2 课题背景

1.3 国际化生产业现状及发展前景

1.4 植物油脂生物合成的途径

1.5 植物脂肪酸的研究进展

1.6 三酰甘油合成酶—DGTA的研究进展

1.7 主要研究内容

第2章 花生总脂和脂肪酸含量的分析

2.1 实验材料与试剂

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第 3 章 AhFAD6、AhDGAT1-1、AhDGAT1-2 和AhDGAT3-3基因的表达特性研究

3.1 试验材料与试剂

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 AhFAD6基因在聚球藻PCC7942中的表达

4.1 实验材料与试剂

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章：AhDGAT1-1、AhDGAT1-2、AhDGAT3-3基因在酿酒酵母中的表达

5.1 实验材料与试剂

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 本章小结

结论

参考文献

声明

致谢