黑芸豆凝集素的纯化和生物信息学及结构与功能特性研究

摘要

凝集素是一类具有重要生物活性的糖蛋白，可用于血型鉴定、细胞信号传导、恶性肿瘤细胞抑制、免疫应答和药物靶向定位的研究中，同时，凝集素也是食品中的抗营养因子。凝聚素主要存在于豆类中，黑芸豆是种植量较大的芸豆品种之一，研究发现黑芸豆中凝聚素的含量较高，但对黑芸豆凝集素的结构及生物学性质的认识非常有限。本文对黑芸豆凝集素的分离纯化、凝集素的结构、凝集素的理化性质及生物学特性与凝集素结构之间的关系进行了系统性研究，可为豆类凝集素功能性开发提供理论基础。
　　本研究采用反胶束萃取方法对芸豆水溶性蛋白粗提取物中的凝集素进行了分离纯化，并研究了反胶束萃取方法对凝集素活性和结构的影响。确定反胶束萃取凝集素的工艺参数为：前萃取水相NaCl浓度为77.6 mmol/L，pH值为5.7，AOT（二(2-乙基已基)丁二酸酯磺酸钠）浓度为127.4 mmol/L；后萃取水相KCl浓度为593.0 mmol/L，pH值为8.0；在最佳工艺条件下，凝集素的得率为63.2±2.4 mg蛋白/g豆，纯化倍数为8.8±0.2倍。反胶束萃取法对凝集素的活性没有影响；经傅立叶变换红外光谱和圆二色光谱分析可知，反胶束萃取对凝集素蛋白二级结构没有显著的影响。反胶束法萃取的凝集素样品经色谱纯化后纯度可达到94％以上，比传统的离子交换和分子筛纯化方法的蛋白得率提高了70%。
　　基于LC-MS/MS方法，确定反胶束萃取分离纯化的蛋白为凝集素，与PHA-E蛋白具有高度同源性。以黑芸豆基因组DNA为模板，依据PHA-E蛋白cDNA序列合成的特异引物进行同源克隆，获得黑芸豆凝集素蛋白的编码基因序列。根据同源分析和进化分析可知，黑芸豆凝集素高度保守，可能与PHA-E蛋白共同分化自Arc7变种。根据对黑芸豆凝集素的生物信息学分析，黑芸豆凝集素为亲水蛋白，具有较高的稳定性，含有疏水内核区；在生理 pH值下黑芸豆凝集素可能以四聚体形式存在，含有高度保守的Lectin_legB功能结构域；蛋白分子中含有Ca2+和Mn2+结合位点及可能与 N端糖基特异性结合的位点；研究表明黑芸豆凝集素含有B淋巴细胞抗原表位和T淋巴细胞抗原表位，具有潜在的抗癌细胞活性。
　　黑芸豆凝集素单体分子量为31 kDa，四聚体分子量约为116.97 kDa；黑芸豆凝集素单体的等电点在5.27左右，二聚体等电点在6.03左右，四聚体等电点在6.91左右。利用荧光光谱法证明黑芸豆凝集素蛋白可与N-乙酰-D-葡萄糖胺发生特异性结合，亲和常数约为0.45 mmol/L，为中等强度的亲和作用。基于凝集素活性恢复的方法，证明黑豆凝集素为金属离子依赖性蛋白，Mn2+和Ca2+是黑芸豆凝集素蛋白的必需金属离子。对黑芸豆凝集素热失活与蛋白构象之间的关系进行研究，发现加热导致凝集素蛋白折叠结构的打开，使凝集素发生变性，凝集素的热变性程度与加热温度和时间呈函数关系，其热稳定性符合一级动力学模型。采用紫外、荧光光谱和DSC法对黑芸豆凝集素的酸碱稳定性进行研究，结果表明在pH2.0～10.0范围内凝集素具有相对稳定的蛋白构象。
　　采用指数数学模型分析电泳条带光密度变化，建立了较为准确的体外模拟胃肠道消化评价体系，研究结果表明：黑芸豆凝集素在模拟胃液和胰蛋白酶消化环境下稳定性较好，半衰期分别为23 min和大于90 min；加热和去离子化处理改变了凝集素的蛋白构象，使得凝集素在模拟胃肠道环境下的消化性提高。MTT实验研究证明，在2 h内黑芸豆凝集素对肠道模拟上皮细胞无明显毒性作用。致敏实验证明低剂量黑芸豆凝集素（6 mg/120 g大鼠）未诱发动物模型的致敏症状，黑芸豆凝集素可同时促进IL-4和INF-γ细胞因子的分泌，两者的拮抗作用可能导致IgE抗体的表达未达到阳性症状水平，研究结果证明低剂量黑芸豆凝集素蛋白不具有致敏性。
　　初步研究了黑芸豆凝集素对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用，黑芸豆凝集素的IC50值为9.85μg/mL，凝集素对Hela细胞的抑制能力与作用剂量和时间呈正相关，高剂量的凝集素可使Hela细胞凋亡或坏死；当凝集素浓度低于IC50值时，Hela细胞以凋亡为主，当凝集素浓度高于IC50值时，Hela细胞以晚期凋亡和死亡为主；此外，黑芸豆凝集素能显著地影响 Hela细胞周期分布，阻止 Hela细胞从G1期进入S期，并对G2/M期也有一定的阻滞作用。

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第1章 绪论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 凝集素学的研究进展

1.3 芸豆凝集素的研究进展

1.4 本论文的主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料和设备

2.2 测定方法

2.3 课题组前期研究进展及研究对象选择

2.4 反胶束分离纯化黑芸豆凝集素的实验

2.5 黑芸豆凝集素的蛋白鉴定及生物信息学分析实验

2.6 黑芸豆凝集素的性质与结构关系研究实验

2.7 黑芸豆凝集素的生物安全性和抑制Hela细胞增殖作用实验

2.8 数据处理

第3章 反胶束分离纯化黑芸豆凝集素的研究

3.1 引言

3.2 芸豆水溶性蛋白的提取工艺研究

3.3 黑芸豆凝集素的前萃取工艺参数研究

3.4 黑芸豆凝集素的后萃取工艺参数研究

3.5 反胶束萃取黑芸豆凝集素的优化设计

3.6 反胶束萃取对黑芸豆凝集素蛋白结构的影响

3.7 本章小结

第4章 黑芸豆凝集素的蛋白鉴定及生物信息学分析

4.1 引言

4.2 黑芸豆凝集素蛋白的鉴定及基因克隆

4.3 黑芸豆凝集素的蛋白序列分析

4.4 黑芸豆凝集素蛋白的生物信息学分析

4.5 本章小结

第5章 黑芸豆凝集素的性质与结构关系研究

5.1 引言

5.2 黑芸豆凝集素的基本物理特性

5.3 黑芸豆凝集素的亲和特性研究

5.4 黑芸豆凝集素的热失活与蛋白构象之间的关系

5.5 黑芸豆凝集素酸碱稳定性与蛋白构象之间的关系

5.6 本章小结

第6章 黑芸豆凝集的生物安全性和抑制Hela细胞增殖作用

6.1 引言

6.2 黑芸豆凝集素的体外消化性

6.3 黑芸豆凝集素的致敏性

6.4 黑芸豆凝集素抗人宫颈癌细胞活性的初步研究

6.5 本章小结

结论

创新点

展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢

个人简历