高硫酸化魔芋葡甘低聚糖结构特征及抗病毒活性研究

摘要

本文以丙酯化魔芋葡甘低聚糖 (KGM)为原料，经甲酰胺-氯磺酸酯化得到魔芋低聚 KGM 醛酸丙酯硫酸酯钠盐 (HOGS)，从 HOGS 的分离纯化、结构分析和抗病毒活性三个方面进行了研究。 (1) 甲酰胺-氯磺酸法制备 HOGS，乙醇沉淀法提取，717 阴离子交换树脂分离纯化，然后进行透析脱盐，冷冻干燥后得到纯净的 HOGS。硫酸-蒽酮法测定其糖含量为 64.09％，比浊法测定其硫酸基含量为 33.11％。采用 SephadexG-25 凝胶层析和醋酸纤维薄膜电泳进行纯度鉴定，凝胶层析结果显示只有一个峰，醋酸纤维薄膜电泳显示只有一条蓝色条带，表明所得HOGS 为一均一成分的低聚糖，然后将一次磺化 HOGS 样品再次硫酸化，经分离纯化后得二次磺化HOGS样品。 (2) 利用高效液相色谱 (HPLC)、傅立叶红外光谱 (FT-IR)、激光拉曼光谱 (RS)、X 衍射光电子能谱 (XPS)、核磁共振波谱 (NMR)、凝胶色谱 (GPC) 等现代仪器分析手段对 HOGS 的结构进行分析。结果表明低聚 KGM 经丙酯化修饰和硫酸酯化后，糖环的C<,2>和C<,3>位的羟基上和 C<,6>位连接的羟丙基上的羟基接有硫酸基团，且硫元素的相对含量为7.94％，二次磺化后得到的HOGS 经过XPS分析显示S元素含量比一次磺化 HOGS 提高了约40％。 (3)在抗脊髓灰质炎病毒(PV)中采用一次磺化HOGS样品，利用MTT法研究了 HOGS 抗PV作用，结果表明 HOGS 在浓度为 1.25mg/mL 以内时对Hela细胞无明显细胞毒性作用，细胞的半数中毒浓度TC<,50>为 1.5399mg/ml。将HOGS与病毒的不同作用方式进行分组进行了HOGS抗PV病毒作用的研究。结果表明HOGS对细胞有较好的保护作用，能抑制PV在细胞内的增殖，而且对PV的吸附、穿入等环节随着时间的延长其效果有所增强，其最小有效浓度为 0.01562mg/ml。在抗乙肝病毒(HBV) 中同样采用一次磺化HOGS 样品，利用MTT法和ELISA法，研究了HOGS对HepG<,2>-2.2.15 细胞表达 HBsAg、HBeAg 的影响。结果表明，HOGS 在 0.125mg/mL～1mg/mL 浓度范围对HepG<,2>-2.2.15 细胞没有明显的细胞毒性作用，细胞的半数中毒浓度 TC<,50>为 1.4753mg/mL；并且可明显抑制HepG<,2>-2.2.15 细胞HBsAg的表达，其半数有效浓度IC<,50>为0.2675mg/mL，抑制指数(TI)达5.52，表明HOGS具有一定的体外抗 HBV作用。 (4)在抗柯萨奇病毒(CVB<,3>)中采用二次磺化HOGS 样品，利用MTT法研究了HOGS 抗 CVB<,3>作用，结果显示HOGS在浓度为 0.5mg/ml 以下时均无明显细胞毒性作用，细胞的半数中毒浓度 TC<,50>为 0.6677mg/ml。将 HOGS 与病毒的不同作用方式进行分组进行了 HOGS 抗 CVB<,3>作用的研究。结果显示对CVB<,3>侵入细胞的阻断作用组效果较好，其半数有效浓度IC<,50>为 0.1483mg/ml，TI 值为 4.50；同时将一次磺化 HOGS样品抗病毒药效进行对比，对 CVB<,3>侵入细胞的阻断作用组IC<,50>为0.3767mg/ml，TI值为4.09。由此可表明一次及二次磺化HOGS能有效地抗CVB3的作用，且二次磺化HOGS效果更明显。在抗流感病毒中采用二次磺化HOGS样品，采用MTT法测细胞毒性，结果表明HOGS在浓度为0.5mg/ml以下时均无明显细胞毒性作用，通过测定红细胞血凝效价，得知HOGS可在一定程度上降低病毒感染细胞的血凝效价，其最小有效浓度为0.03125mg/mL。与一次磺化HOGS的血凝效价结果进行对比，得知二次磺化 HOGS 抑制病毒效果明显优于一次磺化HOGS。说明抗病毒活性与硫酸根的含量正相关。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

1.1病毒与抗病毒药物的研究现状

1.2硫酸化多糖的抗病毒活性

1.3硫酸化多糖抗病毒活性的构效关系

1.3.1硫酸根

1.3.2分子量及化学结构

1.4硫酸化多糖抗病毒作用机理

1.5硫酸化多糖的临床应用

1.6硫酸化多糖抗病毒的研究进展

1.6.1抗脊髓灰质炎病毒

1.6.2抗乙肝病毒

1.6.3抗流感病毒

1.6.4抗柯萨奇病毒

1.7课题研究宗旨与目的

第2章低聚KGM醛酸丙酯硫酸酯钠盐的制备

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料与试剂

2.2.2仪器与设备

2.2.3实验方法

2.3结果与分析

2.3.1低聚KGM醛酸丙酯硫酸酯钠盐的制备纯化

2.3.2样品中糖含量和硫酸基含量的测定

2.3.3样品纯度鉴定结果

2.4小结

第3章低聚KGM醛酸丙酯硫酸酯钠盐结构分析

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料与试剂

3.2.2仪器与设备

3.2.3实验方法

3.3结果与分析

3.3.1高效液相色谱

3.3.2红外光谱

3.3.3激光拉曼光谱

3.3.4 X衍射光电子能谱

3.3.5核磁共振光谱

3.3.6凝胶色谱分析

3.4小结

第4章低聚KGM醛酸丙酯硫酸酯钠盐(一次磺化)抗病毒作用研究

4.1抗脊髓灰质炎病毒作用

4.1.1引言

4.1.2材料与方法

4.1.3结果与分析

4.1.4小结

4.2抗乙肝病毒作用

4.2.1引言

4.2.2材料与方法

4.2.3结果与分析

4.2.4小结

第5章低聚KGM醛酸丙酯硫酸酯钠盐(二次磺化)抗病毒作用研究

5.1抗柯萨奇病毒作用

5.1.1引言

5.1.2材料与方法

5.1.3结果与分析

5.1.4小结

5.2抗流感病毒作用

5.2.1引言

5.2.2材料与方法

5.2.3结果与分析

5.2.4小结

第6章低聚KGM醛酸丙酯硫酸酯钠盐(一次及二次磺化)抗病毒作用比较

6.1材料与试剂

6.2实验方法

6.2.1抗柯萨奇病毒

6.2.2抗流感病毒

6.3结果与分析

6.3.1 HOGS(一次及二次磺化)抗CVB3药效对比

6.3.2 HOGS(一次及二次磺化)抗流感病毒药效对比

6.4小结

第7章研究总结

7.1研究结论

7.1.1 HOGS的制备工艺

7.1.2 HOGS的结构特征

7.1.3 HOGS的抗病毒药效

7.2研究的创新之处

7.3研究展望

参考文献

致谢

附录