山羊干扰素-γ与白细胞介素-2的克隆、原核表达及其抗血清的制备

摘要

本文对山羊干扰素-γ与白细胞介素-2的克隆、原核表达及其抗血清的制备进行了探讨。本研究根据GenBank上发表的山羊干扰素-γ和白细胞介素-2基因序列，设计了两套引物。应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中分别克隆了二者，将其克隆到pMD18-T载体中，经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析，表明扩增片段分别为山羊IFN-γ和IL-2基因。测序结果显示克隆的IFN-γ基因全长501个核苷酸，编码166个氨基酸，该基因与GenBank发表的山羊干扰素-γ基因序列比较，核苷酸/氨基酸序列同源性为99.4％。经SignalP 3.0分析表明，前23个氨基酸为信号肽序列；IL-2基因开放阅读框架共有468bp，编码一条155个氨基酸的多肽，与GenBank发表的山羊白细胞介素-2基因序列(AF535145)比较核苷酸/氨基酸同源性为100.0％，与应琦华等的山羊IL-2序列的同源性为99.1％，前20个氨基酸为该蛋白的信号肽序列。应用DNA重组技术，将IL-2基因和去除信号肽的IFN-γ基因分别插入到原核表达载体pET-30a(+)的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ位点上，构建原核表达质粒pET30a-CaplL-2和pET30a-CaplFN-γ，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳，结果表明目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式融合表达。分别用ProBond<'TM>蛋白纯化试剂盒纯化，用所获得的重组蛋白纯化产物经三次背部皮下多点注射新西兰白兔，制备了兔抗山羊IFN-γ和兔抗山羊IL-2多克隆血清。经Westem Blot鉴定，多克隆抗血清可与纯化的山羊重组蛋白发生特异性反应，说明重组蛋白具有抗原活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1干扰素概述

1.1.1干扰素的发现

1.1.2干扰素的分类

1.1.3干扰素的基因工程研究

1.1.4干扰素主要生物学功能

1.1.5干扰素γ的分子及基因表达过程

1.1.6干扰素γ信号路径

1.1.7干扰素γ的生物学活性

1.1.8干扰素γ的基因工程研究

1.1.9干扰素γ的应用研究

1.2白细胞介素-2概述

1.2.1白细胞介素-2的发现

1.2.2白细胞介素-2的基因和分子

1.2.3白细胞介素-2受体的结构及特性

1.2.4白细胞介素-2的生物学活性

1.2.5白细胞介素-2的应用研究概述

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2载体与受体菌

2.1.3酶类及主要生化试剂

2.1.4引物

2.1.5主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1目的基因的克隆

2.2.2目的基因的原核表达

2.2.3抗血清的制备

3结果与分析

3.1干扰素γ

3.1.1 RT-PCR产物的鉴定结果

3.1.2重组质粒的酶切鉴定

3.1.3 CapIFN-γ基因序列测定结果

3.1.4 CapIFN-γ的序列分析结果

3.1.5重组表达质粒的PCR鉴定结果

3.1.6重组表达质粒的酶切鉴定结果

3.1.7融合蛋白的纯化及SDS-PAGE分析

3.1.8融合蛋白多克隆抗血清的制备及检测

3.2白细胞介素-2

3.2.1 RT-PCR产物的鉴定结果

3.2.2重组质粒的酶切鉴定

3.2.3 CapIL-2基因序列测定结果

3.2.4 CapIL-2的序列分析结果

3.2.5重组表达质粒的PCR鉴定结果

3.2.6重组表达质粒的酶切鉴定结果

3.2.7融合蛋白的纯化及SDS-PAGE分析

3.2.8融合蛋白多克隆抗血清的制备及检测

4讨论

4.1关于实验方法

4.2关于干扰素-γ

4.3关于白细胞介素-2

5结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文