苏云金芽胞杆菌Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白纯化

摘要

金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeoidae)，其幼虫(俗称蛴螬)是一类重要的世界性分布的地下害虫，可危害多种农林植物。20年来全国各地的大量调查表明，蛴螬在地下害虫中危害居首位。本文围绕对鞘翅目暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)铜绿丽金龟(Anomala carpulenta)的幼虫有活性的苏云金芽孢杆菌Cry8Ea1和Cry8Ca2蛋白的表达和纯化进行了研究。 HDSE和HBF-1菌株是苏云金芽孢杆菌的菌株，分别含有cry8Ea1和cry8Ca2的基因，编码Cry8Ea1和Cry8Ca2的原毒素(伴孢晶体)。研究表明，两个菌株表达的伴孢晶体均为球形晶体，相对分子质量为130kU。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化得到60kU的活性毒素，利用分子筛层析(Superdex200)收集60kU的毒素，然后使用阴离子交换层析进一步纯化得到纯的60kU的毒素。对纯蛋白进行生物活性测定，结果表明Cry8Ea1的原毒素与毒素对暗黑鳃金龟幼虫均具有较高活性，Cry8Ea1原毒素的LC50值为9．47μg/克土，胰凝乳蛋白酶消化后纯化的毒素的LC50值为35.39μg/克土;Cry8Ca2的原毒素和毒素对铜绿丽金龟幼虫也具有很高的活性，Cry8Ca2原毒素的LC50值为0.47μg/克土，胰凝乳蛋白酶消化后纯化的毒素的LC50值为0.08μg/克土，胰蛋白酶消化后纯化的毒素的LC50值为0.003μg/克土。本研究建立了Cry8Ea1与Cry8Ca2活性毒素蛋白的纯化方法，通过该方法可大量获得该毒素的纯品，为进一步研究该蛋白的结构与功能，揭示毒素的杀虫机理奠定了良好的基础。 研究中还发现Cry8Ea1和Cry8Ca2蛋白是与DNA相结合的。在本实验中对DNA的作用进行了研究，用透析的方法分别对两种毒素的DNA复合体和去除了DNA的毒素在不同pH条件及不同缓冲液条件下的稳定性进行了比较，结果表明，Cry8Ea1和Cry8Ca2毒素与DNA的复合体的稳定性要比不含DNA的毒素稳定，不易发生沉淀，DNA在维持毒素稳定性中起到重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1杀虫晶体蛋白

1.1.1杀虫晶体蛋白的类型

1.1.2ICPs的杀虫作用机理

1.2 BT杀虫晶体蛋白晶体解析情况及功能研究

1.2.1 Bt杀虫晶体蛋白晶体解析情况

1.2.2解析的晶体蛋白结构的比较

1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白与受体结合

1.2.4三个结构域的Loop及残基与杀虫活性的关系

1.2.5与通道形成相关的作用机制研究进展

1.3地下害虫蛴螬及对其有活性的BT CRY8类基因研究进展

1.4蛋白纯化方法

1.4.1分子筛层析

1.4.2离子交换层析

1.4.3亲和层析

1.5本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2试剂

2.1.3仪器设备

2.1.4培养基

2.1.5供试昆虫

2.2方法

2.2.1 cry8Ea1与cry8Ca2基因的亚克隆

2.2.2 Cry8Ea1与Cry8Ca2原毒素的表达与纯化

2.2.3杀虫测定

2.2.4数据分析处理

3实验结果

3.1 cry8Ea1与cry8Ca2活性区基因亚克隆及在大肠杆菌中表达

3.2含有cry8Ea1与cry8Ca2基因Bt菌株的表达与纯化

3.2.1菌体形态特征观察

3.2.2 Cry8Ea1与Cry8Ca2菌株的表达

3.2.3 Cry8Ea1蛋白的纯化

3.2.4 Cry8Ca2消化毒素的分离纯化

3.3 Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白生物活性的测定

3.3.1 Cry8Ea1蛋白生物活性的测定

3.3.2 Cry8Ca2蛋白生物活性的测定

3.3.3 Cry8Ea1与Cry8Ca2蛋白稳定性实验

3.3.4 Cry8Ca2毒素盐酸胍变性研究

4讨论

5结论

致谢

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的学术论文