苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达

摘要

苏云金芽孢杆菌cry8类基因对叶甲科、金龟科等鞘翅目害虫具有毒杀作用。从菌株HBF-1中克隆的cry8C基因与cry8Ca1基因有一个氨基酸的差异，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry8Ca2基因。本研究对cry8Ca2基因的活性做了进一步分析。　　利用随机突变方法，得到35个不同的独立克隆，分别在Bt无晶体突变株HD-73-中表达，通过对铜绿丽金龟幼虫(蛴螬)的生物活性检测，得到两个杀虫活性明显提高的突变体；序列测定结果表明两个突变体分别在第439位的Q(Gln)突变为P(Pro)和第642位E(Glu)突变为G(Gly)。　　以cry8Ca2基因为模板，通过PCR扩增得到九个不同末端缺失的基因片段，构建到pET21b载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，得到9个末端缺失的蛋白；通过生物活性检测，确定Cry8Ca2蛋白对蛴螬的活性区位于70-659个氨基酸之间。　　在上述研究的基础上，对编码Cry8Ca2蛋白的1-680氨基酸的核苷酸序列进行了改造和密码子优化，使其在植物中高效表达。优化的mcry8Ca2(modifiedcry8Ca2)与cry8Ca2基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca2基因的37％提高到46％。

目录

摘要

前言

1、苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因

1.1苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类

1.2苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构

1.3苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理

2、地下害虫蛴螬的危害与防治

3、苏云金芽孢杆菌cry8类基因的研究

4、Bt转基因植物的研究进展

4.1 Bt转基因植物概述

4.2 Bt基因的改造

4.3昆虫对Bt产生抗性的问题

5、本研究的目的意义

第一部分苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry8Ca2的活性研究

第一章cry8Ca2基因的随机突变分析

1.1材料和方法

1.2结果与分析

1.3讨论

第二章Cry8Ca2蛋白活性区的研究

2.1材料和方法

2.2结果与分析：

2.3讨论

第二部分改造的cry8Ca2基因在转基因烟草中的表达

第三章Bt cry8Ca2基因的改造

3.1材料与方法：

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章烟草根特异性启动子的克隆和活性分析

4.1材料和方法

4.2结果与分析

4.3讨论

第五章mcry8Ca2基因在转基因烟草中的活性分析

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3讨论

结论

参考文献

博士后期间发表的文章和申请专利

致谢