猪圆环病毒PCR-RFLP分型方法的建立及其国内流行毒株的遗传变异分析

摘要

猪圆环病毒2型(PorcineCircovirusType2，PCV2)是近些年来对养猪业危害最严重的病毒之一，主要包括断奶猪多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病(PorcineRespiratoryDiseasecomplex,PRDS)、猪皮炎和肾炎综合征(PorcineDernmatisandNephropathySyndrome，PDNS)、幼龄仔猪A2型先天性震颤(CongenitalTremors，CT)、间质性肺炎(InterstitialPneumonitis，IP)、增生性坏死性肺炎(ProliferationNecrotizingPneumonia,PNP)等。PCV2的感染能降低猪体免疫力，常引起其他病原微生物的继发并发感染，加重病情。自1982年命名以来，发展迅速，在世界许多国家和地区广泛流行，给世界养猪业造成巨大的经济损失，严重影响着世界养猪业的发展。我国很多地区也陆续报道有PCV2流行，黑龙江省有PCV2感染的疑似病例，黑龙江省兽医卫生防疫站的张加勇等已经对黑龙江省内的6个地(市)十个种猪场进行了PCV2血清学调查，但尚无病原学诊断的证据，为了为PCV2的实验室诊断提供一种可靠的病原学检测方法，本研究旨在建立一种快速、方便的PCV的PCR-RFLP分型方法适用于现地检测。通过对GenBank中公布的8株PCV2和8株PCV1基因组全序列的比较分析，设计一对PCV2特异引物，含有特异性酶切位点EcoRI和一对PCV1特异引物，含有特异性酶切位点HincⅡ；两对引物均含ORF2。建立了一种快速检测PCV1和PCV2的敏感、特异、重复性好的PCR-RFLP鉴别诊断方法，应用本方法对对国内部分地区的PCV2分离株的ORF2遗传变异情况进行了分析，9株PCV2的ORF2基因核酸序列同源性比较，同源性大于97％，在进化树上与国内的分离株处于同一分支上，关系最近；PCV2的ORF2呈现一定的地域性和相对的稳定性。在发病猪病料中检测到2株PCV1，实验室保存的PK-15细胞检测剑1株PCV1，并进行了全基因组的测序：J5-PCV11758bp；G1-PCV11759bp:Wen-PCV11759bp。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.引言

1.1病原简介

1.2流行病学现状

1.3临床观察与病理损伤

1.4诊断方法研究

1.4.1 PCR诊断技术

1.4.2间接免疫荧光试验

1.4.3免疫组化法

1.4.4核酸探针及原何杂交

1.4.5免疫过氧化物酶单层细胞试验

1.4.6酶联免疫吸附试验

1.5疫苗研究

1.6防制研究

1.7问题与展望

1.8本研究的目的意义

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒与细胞

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1猪圆环病毒PCR-RFLP分型方法的建立

2.2.2病毒的分离

2.2.3国内部分地区PCV分子流行病学调查

2.2.4部分猪场PCV2 ORF2的克隆与序列分析

2.2.5 PCV1分离株全基冈组的克隆

3.结果与分析

3.1猪圆环病毒PCR-RFLP分型方法的建立

3.1.1 PCR扩增

3.1.2温度梯度试验

3.1.3特异性试验

3.1.4敏感性试验

3.1.5限制内切酶多态性分析

3.1.6 PCR扩增条件的优化

3.2病毒的分离

3.2.1 PCR检测

3.2.2间接免疫荧光方法鉴定PCV分离株

3.2.3电镜观察

3.2.4分离株的序列分析

3.3国内部分地区PCV分子流行病学调查

3.4部分猪场PCV2 ORF2核苷酸及推导氨基酸序列分析

3.5 PCVl分离株全基因组的克隆

3.5.1 PCV1分离株的PCR扩增

3.5.2重组质粒的酶切鉴定

3.5.3 PCV1分离株的序列分析

4.讨论

5.结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文