阿米洛利结合蛋白1在小鼠早期妊娠子宫中的表达与调节

摘要

胚胎着床需要子宫内膜接受态的建立以及胚胎发育到具有黏附能力的胚泡同步进行。胚胎着床开始后的蜕膜化过程中,子宫内膜基质细胞发生增殖和分化。在胚胎着床和蜕膜化过程中,组胺和多胺等胺类发挥着重要的作用。来源于母体子宫的组胺与胚胎上的组胺受体相互作用有利于着床过程。细胞中多胺水平的平衡对于维持细胞增殖等过程非常重要。但这些具有生物活性的胺类的过量积累,会破坏细胞稳态,甚至导致细胞凋亡。阿米洛利结合蛋白1(amiloride binding protein1,Abp1)是哺乳动物体内代谢组胺和腐胺等胺类的主要降解酶,对于维持生物胺类水平的平衡具有很重要的作用。
　　本实验利用原位杂交、实时定量PCR和Western blot等方法,检测了Abp1在小鼠早期妊娠子宫中的表达,并利用假孕、延迟着床、人工诱导蜕膜化和激素处理等多种模型研究了Abp1在子宫中的调节。在体外细胞培养水平,我们检测了类固醇激素对Abp1的调节,以及在诱导蜕膜化过程中Abp1表达的变化。此外,通过启动子及荧光素酶分析等方法,我们研究了Cebpb和cAMP在早期妊娠过程中对Abp1的调节作用。Abp1 mRNA在妊娠第5天子宫着床位点处腔上皮下基质中显著上调,之后持续表达于正在发生蜕膜化的基质细胞中,并随着妊娠过程的发展,在蜕膜区的表达逐渐增强。在假孕第1-5天以及延迟着床子宫中检测不到Abp1的表达,而在延迟后激活子宫的着床位点,Abp1的表达增强。人工诱导蜕膜化模型中,对照侧子宫中检测不到Abp1的表达,而诱导蜕膜化的子宫中Abp1大量表达。通过体外诱导蜕膜化模型发现,在诱导蜕膜化的细胞中,Abp1表达增强。我们证实,在Abp1启动子上存在cAMP的反应元件,cAMP处理能够上调Abp1的表达。由于Abp1的表达主要定位于子宫内膜的基质细胞中,将培养的子宫基质细胞用类固醇激素处理时,Abp1的表达受孕酮上调,雌激素对孕酮的上调效应起抑制作用。孕酮受体拮抗剂RU486处理可逆转孕酮对Abp1的上调作用,说明孕酮通过其受体PR实现对Abp1的调节。通过启动子分析,在Abp1的启动子上找到了转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(Cebpb)的结合位点。
　　利用双荧光素酶分析,证实Cebpb对Abp1具有上调作用。当把Abp1启动子上Cebpb的结合位点突变后,Cebpb对Abp1的上调作用显著降低。我们的结果表明,Abp1的表达受活性胚胎的调节,且在蜕膜化过程中表达逐渐增强。Abp1的表达受孕酮、cAMP和Cebpb上调。Abp1可能在小鼠胚胎着床及蜕膜化过程起重要作用。

目录

摘要

ABSTRACT

1 引言

1.1 早期妊娠过程及分子调控

1.1.1 着床及蜕膜化

1.1.2 早期妊娠的分子调控

1.2 组胺、多胺及相关基因

1.2.1 组胺和多胺

1.2.2 组胺与多胺的相互作用

1.2.3 胺类代谢相关酶

1.2.4 组胺、腐胺与γ-氨基丁酸

1.3 组胺、多胺及代谢相关酶与生殖

1.3.1 组胺及相关酶与生殖

1.3.2 多胺及相关酶与生殖

1.4 转录因子 Cebpb

1.4.1 转录因子调节机制

1.4.2 Cebpb 与早期妊娠

1.5 研究的目的及意义

2 材料和方法

2.1 实验动物

2.2 实验动物模型

2.2.1 早期妊娠

2.2.2 假孕模型

2.2.3 延迟着床及激活

2.2.4 卵巢类固醇激素处理

2.2.5 人工蜕膜化

2.3 小鼠子宫内膜细胞培养

2.3.1 培养前的准备工作

2.3.2 小鼠子宫内膜原代基质细胞的分离与培养

2.3.3 小鼠子宫基质细胞的体外诱导蜕膜化

2.3.4 小鼠子宫蜕膜细胞的分离与培养

2.4 原位杂交

2.4.1 cRNA 探针的制备

2.4.2 原位杂交实验

2.5 实时定量PCR

2.5.1 RNA 提取

2.5.2 反转录

2.5.3 引物序列

2.5.4 实时定量PCR 反应

2.5.5 融解曲线分析

2.6 Western Blot

2.6.1 试剂及溶液

2.6.2 样品提取及蛋白浓度测定

2.6.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.6.4 Immunoblot 及ECL 显影

2.7 Cebpb 过表达

2.8 载体构建与荧光素酶活性分析

2.8.1 重组质粒Abp1-pGL3 的构建

2.8.2 Abp1 启动子序列定点突变

2.8.3 荧光素酶活性分析

2.9 数据统计

3 结果

3.1 Abp1 探针制备

3.2 Abp1 在早期妊娠围着床期小鼠子宫中的表达

3.2.1 原位杂交检测Abp1 在早期妊娠围着床期小鼠子宫中的表达

3.2.2 围着床期Abp1 表达的定量分析

3.3 活性胚泡对 Abp1 表达的影响

3.3.1 原位杂交检测Abp1 mRNA 在假孕子宫中的表达

3.3.2 原位杂交检测Abp1 mRNA 在延迟着床和激活子宫中的表达

3.4 蜕膜化过程中ABP1 的表达

3.4.1 原位杂交检测Abp1 mRNA 在体内蜕膜化中的表达

3.4.2 实时定量PCR 检测诱导蜕膜化中Abp1 的表达

3.4.3 cAMP 对Abp1 表达的调节

3.4.4 阿米洛利（amiloride）对蜕膜化过程的调节

3.5 类固醇激素对ABP1 作用

3.5.1 实时定量PCR 检测激素对Abp1 mRNA 的调节

3.5.2 Western Blot 检测孕酮对Abp1 蛋白的调节

3.6 组胺和腐胺对子宫基质细胞中ABP1 表达的影响

3.6.1 组胺和腐胺对细胞中Abp1 mRNA 表达水平的调节

3.6.2 组胺对细胞中Abp1 蛋白表达的调节

3.7 ABP1 表达的转录水平调节

3.7.1 Abp1 基因启动子序列分析预测

3.7.2 Cebpb 对Abp1 表达的调节

4 讨论

4.1 ABP1 在早期妊娠子宫中的表达

4.2 组胺和多胺对ABP1 表达的调节

4.3 ABP1 与蜕膜化

4.4 类固醇激素对ABP1 的调节

4.5 CEBPB 对ABP1 的调节

5 结论

致谢

参考文献

图版

攻读博士期间发表的论文