乳制品中生物素快速检测方法建立及应用研究

摘要

生物素是乳制品中众多营养物质之一,参与机体三大营养物质的代谢,是动物机体内不可缺少的一种水溶性维生素。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性,因此在婴幼儿乳制品、孕产妇乳制品及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。目前,我国现行的检测标准(GB/T5413.19-1997).微生物法是唯一检测乳制品中生物素的方法。此法虽然灵敏度高,检出限低,但是该方法操作繁琐,检测周期长,干扰因素多,重复性差的缺点限制了的该方法的应用。因此,迫切需要一种快速、简便、稳定可行、普适性强的方法测定生物素的含量。故此,建立本课题展开这方面的研究。
　　本研究先以基质复杂的配方乳粉为研究对象,通过对生物素的提取条件、固相萃取条件、衍生条件以及液相色谱条件进行重点研究,建立一种可以用高效液相色谱仪对乳制品中生物素进行定性、定量检测的方法,并对此方法进行可行性分析和推广性验证。针对乳制品中生物素的痕量、动态以及基质复杂、干扰物质多等问题,引入了固相萃取(SPE)技术。本文通过对固相萃取条件、衍生条件和液相色谱条件进行优化,得到了较好的实验研究结果。
　　本研究得到的结果如下:1.生物素提取条件的优化确定的最佳超声萃取条件为:50℃×15min;最佳沉淀蛋白条件为:添加0.8~0.9mL10％HCl溶液。2.固相萃取条件的优化确定的最佳固相萃取条件为:①活化:6mL100％甲醇,2mL水,5mL1％的醋酸;②上样:5mL的样品清夜加到柱床上,控制流速在60d/min;③淋洗:5mL1％的醋酸,2mL去离子水;④洗脱:10mL100％甲醇。3.衍生反应条件的确定通过对反应温度和反应时间进行比较,确定生物素衍生化反应的最佳条件为:50℃水浴避光反应60min。4.色谱条件色谱柱为BDS HYPERSIL C18(250×4.6mm i.d.5μm);柱温为50℃;检测器为荧光检测器,检测波长:Ex为340nm,Em为395nm;流动相为水-乙腈,梯度洗脱(洗脱程序见表3-2);流速1mL/min;进样量10μL;分析时间35min。5.SPE-HPLC(FLD)方法检测乳制品中生物素的方法学评价对所建立的SPE-HPLC检测乳制品中生物素的方法进行方法学评价,包括:精密度、稳定性、灵敏度及回收率等。样品的日内、日间精密度试验的RSD值均小于3％,具有较好的精密度;生物素的最低检出限为25ng/mL;固相萃取回收率和方法回收率均为:90~100％;衍生物24h内稳定,线性范围为25~300ng/mL,相关系数为0.9996。
　　本文对市场上多种奶粉、原料粉、原料奶和婴儿米粉等进行了推广性验证分析,结果表明此方法实用、可行。所建立的方法和传统的微生物法相比,方法操作简单,快速,选择性强,能克服传统方法中繁琐,重现性低等缺陷和不足。截至目前,这些都是首创。这在痕量生物素的精确定量方面不仅具有非常重要的理论意义,而且具有广大的应用前景。

目录

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 立题背景

1.2 生物素概述

1.2.1 生物素的结构及其理化性质

1.2.2 生物素的生物学特性

1.2.3 生物素的人体需求量

1.2.4 生物素缺乏症状

1.3 我国国标的相关规定

1.3.1 食品中生物素的限量要求

1.3.2 生物素检测的相关标准

1.4 目前生物素检测方法研究进展

1.5 固相萃取(SPE)技术的应用

1.5.1 固相萃取概述

1.5.2 固相萃取技术的作用机理及分离模式

1.5.3 固相萃取的吸附剂

1.5.4 固相萃取技术具有的主要特点

1.5.5 固相萃取方法的建立

1.6 本研究的目的和意义

1.7 本研究的拟采取的技术路线

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 待测样品

2.1.2 主要试剂及来源

2.1.3 主要试剂的配制

2.2 仪器和设备

2.3 试验方法

2.3.1 标准溶液的配制

2.3.2 样品中生物素的提取

2.3.3 固相萃取富集、净化样品

2.3.4 生物素衍生化反应

2.3.5 液相色谱检测条件的优化

2.3.6 标准曲线的制备

2.3.7 生物素快速检测方法的可行性

2.3.8 方法的推广性验证

2.3.9 数据处理

3 结果与分析

3.1 样品中生物素的提取

3.1.1 超声萃取条件的优化

3.1.2 蛋白质沉淀条件的优化

3.2 使用固相萃取技术(SPE)富集净化样品

3.2.1 固相萃取小柱活化

3.2.2 淋洗剂用量的优化

3.2.3 洗脱剂用量的优化

3.2.4 上样量的确定

3.3 生物素衍生化反应

3.3.1 衍生反应温度的优化

3.3.2 衍生剂浓度的确定

3.4 色谱条件的确定

3.4.1 色谱柱的选择

3.4.2 流动相不同洗脱条件的选择

3.4.3 分离温度的选择

3.4.4 检测波长的确定

3.4.5 目标峰的判定

3.5 试验方法确定

3.6 标准曲线的制备

3.7 生物素快速检测方法的可行性

3.7.1 最低检测浓度确定

3.7.2 精密度试验结果

3.7.3 回收率试验结果

3.7.4 稳定性试验

3.8 方法的推广性验证

4 讨论

4.1 液相色谱在生物素分析中的应用

4.2 本研究的创新点

4.3 实验材料的选定

4.4 沉淀体系的选择

4.5 推广性验证结果分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文