二丁酰环腺苷酸对肥育猪胴体品质和肉质的影响及机理研究

摘要

本课题主要探讨二丁酰环腺苷酸对肥育猪胴体品质和肉质的影响及作用机理，主要包括动物饲养试验、脂肪前体细胞培养试验和骨骼肌卫星细胞培养试验三部分。
　　 动物饲养试验：选用72头平均体重约60kg的杜×大×长肥育阉公猪，随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复4头猪。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中分别添加10mg/kg和20mg/kg dbcAMP，自由采食和饮水，饲养至90kg左右结束试验，每重复随机选出1头猪屠宰，研究dbcAMP对肥育猪生产性能、胴体品质和肌肉品质的影响。结果表明：1）饲粮添加dbcAMP未显著影响肥育猪平均日增重、日采食量和料重比。2）添加10mg/kg dbcAMP显著降低肥育猪宰后花板油所占比例和第一肋骨处的背膘厚，第十肋骨处的背膘厚略有降低的趋势；显著提高瘦肉率，无脂瘦肉日增重有升高的趋势，眼肌面积也提高了13.92％。3）添加10mg/kgdbcAMP显著提高了腹部肌肉所占比例，添加dbcAMP臀部肌肉所占比例呈线性上升的趋势变化，背部肌肉所占比例提高了1.71％～1.27％，而前腿和后腿肌肉所占比例有所下降。4）随着dbcAMP添加量的增加，肥育猪背部脂肪细胞直径分别降低了4.37％和7.68％（P<0.05），肌纤维直径有线性上升的趋势（P=0.06）。5）饲粮添加dbcAMP显著增加了血浆环腺苷酸（cAMP）、总蛋白（TP）、甲状腺素（T4）的含量，肾上腺素含量有线性增加趋势（P=0.06），未显著影响血浆胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、生长激素（GH）、胰岛素（INS）、胰岛素样生长因子（IGF-1）和瘦素（Leptin）的含量（P>0.05）。6）饲粮添加dbcAMP对肥育猪背最长肌、股二头肌和半腱肌的pH值、肉色、大理石纹、嫩度和肌内脂肪均无显著影响（P>0.05），添加10mg/kg dbcAMP显著降低了股二头肌宰后24h的滴水损失值（P<0.05），处理组背最长肌和半腱肌宰后24h、48h的滴水损失值均低于对照组（P>0.05）。7）添加10mg/kg dbcAMP显著提高了背脂中激素敏感脂酶（HSL）活性、β肾上腺素受体（β-AR）、生长激素受体（GHR）mRNA表达量（P<0.05），而添加20mg/kg dbcAMP显著降低了过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ2）和脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）mRNA表达量（P<0.05）；添加10mg/kg和20mg/kg dbcAMP均显著提高腹脂中G蛋白偶联受体（GPCR）mRNA表达量（P<0.05）和降低胰岛素受体（INSR）mRNA表达量（P<0.05），同时10mg/kg dbcAMP显著提高了β-AR、GHR mRNA表达量（P<0.05），20mg/kg dbcAMp显著提高了cAMP反应元件结合蛋白（CREB）、IGF-1 mRNA表达量（P<0.05）；添加10mg/kg和20mg/kg dbcAMP均显著抑制肾周脂中的INSR、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、A-FABP mRNA表达量（P<0.05），而20mg/kg dbcAMP显著提高了HSL活性、GPCR、CREB、IGF-1 mRNA表达量以及降低脂肪酸合成酶（FAS）、脂蛋白脂酶（LPL）活性（P<0.05）。8）添加10mg/kg和20mg/kg dbcAMP均显著提高了背最长肌中腺苷酸环化酶（AC）活性、生肌决定因子（MyoD）、α-肌动蛋白（ct-actin）mRNA表达量（P<0.05），同时10mg&g dbcAMP显著提高了GPCR、IGF-1、肌球蛋白重链（MHC）mRNA表达量（P<0.05）；添加10mg/kg和20mg/kg dbcAMP均显著提高了腹肌中cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）活性、GPCR、MHC mRNA表达量（P<0.05），同时10mg/kg dbcAMP显著提高了腹肌中的cAMP含量、CREB、MyoDmRNA表达量（P<0.05）；添加10mg/kg和20mg/kgdbcAMP均显著促进股二头肌中IGF-1、MyoD、MHC mRNA表达量（P<0.05），同时10mg/kgdbcAMP显著提高了GPCR、CREB、a-actin mRNA表达量（P<0.05）；添加dbcAMP显著促进半腱肌中的MyoD mRNA表达量以及降低肌抑素（Myostatin）mRNA表达量（P<0.05）。综合上述结果提示，饲粮添加dbcAMP可以改善胴体品质，促进蛋白质沉积而减少脂肪沉积，且10mg/kg组效果较好。
　　 脂肪前体细胞培养试验：选用7日龄杜×大×长三元杂交仔猪，无菌条件下分离背部皮下脂肪进行脂肪前体细胞培养。使用0、0.001、0.01、0.1、1、10、100、10001μmol/LbcAMP处理细胞1、2、3、4、5、6天，研究dbcAMP对脂肪前体细胞增殖的影响；处理细胞2、4、6、8、10、12天，研究dbcAMP对脂肪前体细胞分化的影响；使用0、0.001、0.1、10、1000μmol/LdbcAMP处理细胞4天，研究dbcAMP对脂肪细胞内与脂肪代谢沉积相关的酶活和基因表达的影响。结果表明：1）添加0.001～1000μmol/LdbcAMP均有抑制脂肪前体细胞增殖的趋势，其中处理前期dbcAMP浓度大于0.01μmol/L即有显著的抑制效果（P<0.05），而处理后期浓度增大至100～1000μmol/L的抑制增殖作用最大（P<0.05）。2）dbcAMP对脂肪前体细胞分化的影响也存在添加浓度和处理时间效应，短期处理（2～6天）时细胞的分化呈先下降再上升的二次曲线变化（P<0.05），且0.1～1μmol/L的抑制分化作用最大（P<0.05），随着处理时间的延长（10～12天），0.1～1000μmol/L均显著抑制脂肪前体细胞分化（P<0.05），其中最大抑制分化浓度增大到100～1000μmol/L（P<0.05）。3）向脂肪前体细胞培养液中添加dbcAMP显著提高了细胞内cAMP含量、PKA活性（P<0.05）和GPCR、β-AR、GHR和CREB mRNA表达量（P<0.05），而显著降低C/EBPα、PPARγ2和A-FABPmRNA表达量（P<0.05）。以上结果提示，添加适量的dbcAMP可抑制脂肪前体细胞增殖和分化，并有抑制脂肪合成的作用。
　　 骨骼肌卫星细胞培养试验：选用7日龄杜×大×长三元杂交仔猪，无菌条件下分离背最长肌进行骨骼肌卫星细胞培养。使用0、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000μmol/LdbcAMP处理细胞1、2、3、4、5、6天，研究dbcAMP对骨骼肌卫星细胞增殖的影响；使用0、0.001、0.1、10、1000μmol/LdbcAMP处理细胞4天，研究dbcAMP对骨骼肌细胞内与蛋白质代谢沉积相关的酶活和基因表达的影响。结果表明：1）随着dbcAMP浓度的增加骨骼肌卫星细胞的增殖呈先升高后下降的二次曲线变化（P<0.0001），除第1天0.1μmol/LdbcAMP显著促进骨骼肌卫星细胞增殖（P<0.05）外，2～6天时均为0.001～0.1μmol/LdbcAMP有促进细胞增殖的趋势，且0.1μmol/L组效果最好（P>0.05），1～1000μmol/L时有抑制细胞增殖的趋势，且1000μmol/L组的抑制增殖作用最大（P<0.05）。2）向骨骼肌卫星细胞培养液中添加dbcAMP显著提高了cAMP含量、AC活性（P<0.05）以及GPCR、MHC mRNA表达量（P<0.05）；显著降低了calpain活性（P<0.05）以及Myostatin mRNA表达量（P<0.05），而有升高calpastatin活性的趋势（P=0.07）；此外，0.1μmol/LdbcAMP均有提高GHR、CREB、IGF-1、MyoD、α-aetin mRNA表达量的趋势（P>0.05）。上述结果提示：一定浓度的dbcAMP可促进骨骼肌卫星细胞增殖，并有促进蛋白质合成和抑制蛋白质降解的作用。
　　 综合三个试验的结果得出，在本试验条件下，细胞中最佳dbcAMP添加浓度为0.1μmol/L，而动物饲养试验中的最佳剂量为10mg/kg，同时得出dbcAMP调控脂肪沉积的可能机理是：适量添加dbcAMP能促进脂肪中β-AR mRNA表达量的增加，dbcAMP与β-AR结合，激活Gs蛋白，进而活化AC，促使细胞内cAMP含量增加，而后激活PKA，活化的PKA释放催化亚基去催化细胞内其它蛋白质（如CREB或HSL）的磷酸化，HSL浓度的提高可使线粒体进入解偶联呼吸状态，底物氧化耗能增加，最终使脂肪分解代谢增强；也可通过降低FAS、LPL的活性和PPARγ2、A-FABP mRNA的表达，抑制脂肪细胞分化，降低脂肪沉积；还可通过降低INSR数量，减少INS与受体结合的机会，抑制INS对体脂沉积的促进作用。得出dbcAMP调控蛋白质沉积的可能机理是：通过GPCR-AC-cAMP-PKA途径，调节转录因子CREB的活性，加速了基因的转录和表达，从而使蛋白质合成增多；通过增加骨骼肌内结构蛋白α-actin和Mt-IC的mRNA表达量以及生肌决定因子MyoD的表达，提高蛋白质的合成量，同时降低肌抑素Myostatin mRNA表达，减少蛋白质的降解量；还可通过GH/IGF-1途径，IGF-1 mRNA表达量的提高，能直接诱导骨骼肌细胞分化，促进DNA合成，从而导致蛋白质合成增加。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 引言

1.1 cAMP的来源及分布

1.2 cAMP的结构与特点

1.3 cAMP的合成和分解

1.3.1 生物合成

1.3.2 化学制备

1.4 cAMP信号通路组成

1.5 cAMP信号通路的传递过程

1.6 cAMP对脂肪代谢的调控

1.6.1 脂肪组织发育沉积规律

1.6.2 脂肪的合成、分解和转运

1.6.3 影响脂肪代谢和沉积的因素

1.6.4 cAMP对脂肪代谢的影响

1.7 cAMP对蛋白质代谢的调控

1.7.1 肌肉组织生长发育规律

1.7.2 影响肌肉生成的因素

1.7.3 cAMP对蛋白质代谢的影响

1.8 其它生物学作用

1.9 本课题的研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 dbcAMP对肥育猪胴体品质以及肉质的影响

2.1.1 试验试剂

2.1.2 试验仪器

2.1.3 试验动物与饲养管理

2.1.4 dbcAMP来源

2.1.5 试验日粮

2.1.6 检测指标及方法

2.1.7 数据分析

2.2 dbcAMP对体外培养的猪脂肪前体细胞的影响

2.2.1 试剂与用品

2.2.2 试验仪器

2.2.3 试剂配制

2.2.4 细胞来源及分离培养

2.2.5 试验设计

2.2.6 检测指标及方法

2.2.7 数据分析

2.3 dbcAMP对体外培养的猪骨骼肌卫星细胞的影响

2.3.1 试剂与用品

2.3.2 试验仪器

2.3.3 试剂配制

2.3.4 细胞来源及分离纯化

2.3.5 骨骼肌卫星细胞鉴定

2.3.6 试验设计

2.3.7 检测指标及方法

2.3.8 数据分析

3 结果与分析

3.1 dbcAMP对肥育猪胴体品质以及肉质的影响

3.1.1 dbcAMP对肥育猪生产性能的影响

3.1.2 dbcAMP对肥育猪胴体品质的影响

3.1.3 dbcAMP对肥育猪肌肉粗蛋白和肌内脂肪含量的影响

3.1.4 dbcAMP对肥育猪脂肪和肌肉组织形态学指标的影响

3.1.5 dbcAMP对肥育猪肌肉大理石纹评分和嫩度的影响

3.1.6 dbcAMP对肥育猪宰后肌肉滴水损失的影响

3.1.7 dbcAMP对肥育猪宰后肌肉pH值的影响

3.1.8 dbcAMP对肥育猪宰后肌肉肉色的影响

3.1.9 小结

3.2 dbcAMP对肥育猪脂肪和蛋白质代谢的影响

3.2.1 dbcAMP对肥育猪血液生化指标的影响

3.2.2 dbcAMP对肥育猪脂肪组织中酶活的影响

3.2.3 dbcAMP对肥育猪肌肉组织中酶活的影响

3.2.4 dbcAMP对肥育猪脂肪组织中基因表达的影响

3.2.5 dbcAMP对肥育猪肌肉组织中基因表达的影响

3.2.6 小结

3.3 dbcAMP对体外培养的猪脂肪前体细胞的影响

3.3.1 脂肪前体细胞的形态学观察

3.3.2 添加dbcAMP对脂肪前体细胞增殖的影响

3.3.3 添加dbcAMP对脂肪前体细胞分化的影响

3.3.4 添加dbcAMP对脂肪细胞内酶活的影响

3.3.5 添加dbcAMP对脂肪细胞内基因mRNA表达量的影响

3.3.6 小结

3.4 dbcAMP对体外培养的猪骨骼肌卫星细胞的影响

3.4.1 骨骼肌卫星细胞的形态学观察

3.4.2 骨骼肌卫星细胞的鉴定

3.4.3 添加dbcAMP对骨骼肌卫星细胞增殖的影响

3.4.4 添加dbcAMP对骨骼肌细胞内酶活的影响

3.4.5 添加dbcAMP对骨骼肌细胞内基因mRNA表达量的影响

3.4.6 小结

4 讨论

4.1 dbcAMP对肥育猪生产性能的影响

4.2 dbcAMP对肥育猪肉质指标的影响

4.3 dbcAMP对肥育猪胴体品质的影响

4.3.1 dbcAMP对肥育猪脂肪代谢与沉积的影响

4.3.2 dbcAMP对肥育猪蛋白质代谢与沉积的影响

4.4 dbcAMP对体外培养的猪脂肪前体细胞的影响

4.4.1 脂肪前体细胞的分离、培养及鉴定

4.4.2 dbcAMP对脂肪前体细胞增殖和分化的影响

4.4.3 dbcAMP对脂肪细胞内脂类代谢的影响

4.5 dbcAMP对体外培养的猪骨骼肌卫星细胞的影响

4.5.1 骨骼肌卫星细胞的分离、培养及鉴定

4.5.2 dbcAMP对骨骼肌卫星细胞增殖的影响

4.5.3 dbcAMP对骨骼肌细胞内蛋白质代谢的影响

4.6 dbcAMP调控肥育猪脂肪和蛋白质代谢沉积的机理

5 结论

致 谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文