用于大豆膳食纤维改性的里氏木霉工程菌的构建

摘要

膳食纤维对人体健康具有特殊的生理功能，因此膳食纤维类食品受到消费者的欢迎，而可溶性膳食纤维被证实具有更好的生理作用和功能特性。目前，大豆可溶性膳食纤维主要通过酶法降解豆渣制备。但是所用的酶制剂含有多种酶组分，每种酶对大豆膳食纤维的改性可能发挥着不同的作用。里氏术霉内切葡聚糖酶EGⅡ、内切木聚糖酶XYNⅠ和XYNⅡ有利于可溶性膳食纤维的生成，而木糖苷酶XYND、β-葡萄糖苷酶BGLⅠ、内切葡聚糖酶EGⅠ、外切葡聚糖酶CBHI等组分不利于可溶性膳食纤维的生成。由此导致酶法制备大豆可溶性膳食纤维产量低、质量差、工艺不稳定等问题。因此，利用基因工程技术培育工程菌，增加有利酶组分、降低不利酶组分，以提高可溶性膳食纤维的产量和质量，具有重要的研究价值。
　　 本课题利用农杆菌介导法转化里氏木霉QM9414，敲除其木糖苷酶基因xynd和β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ，试图为大豆可溶性膳食纤维的生产提供酶制剂工程菌。
　　 主要研究结果如下：
　　 1.农杆菌介导的里氏木霉遗传转化体系的建立和优化本实验优化了农杆菌转化条件，主要从共培养的时间、温度、和菌体的浓度等方面进行了优化。结果表明当乙酰丁香酮的浓度为200μmol/L，共培养时间为42h，温度24℃，孢子浓度为107个/ml和农杆菌初始浓度OD660为0.25时，转化效率较高。
　　 2.△ura3缺陷型菌株的筛选构建了ura3缺失基因的载体pEMT-△ura3，并将pEMT-△ura3质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101中，与里氏木霉共培养，筛选转化子，获得ura3缺陷型菌株1株，其同源重组率为16.6％。
　　 3.△ku70缺陷型菌株筛选构建了ku70基因敲除载体pEMT-pyrA，并将pEMT-pyrA质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101中，与ura3缺陷性菌株共培养，筛选转化子，获得ku70缺陷型菌株1株，其同源重组率为25％。
　　 4.里氏木霉木糖苷酶xynd基因、bglⅠ基因的敲除通过重叠延伸PCR的方法将.xynd5，bgⅠ3，xynⅡ三个基因重叠延伸在一起。构建了xynd-bglⅠ-xynⅡ基因敲除载体pEMT-△xynd-pyrA，并将pEMT-△xynd-pyrA质粒通过冻融法转入农杆菌GV3101中，与ura3缺陷性菌株共培养，筛选转化子，获得敲除xynd、bglⅠ基因的工程菌株。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 引言

1.1 本研究的目的和意义

1.2 文献综述

1.2.1 大豆膳食纤维

1.2.2 大豆膳食纤维改性酶制剂

1.2.3 食品级酶制剂表达系统的研究

1.2.4 丝状真菌遗传转化系统

1.2.5 农杆菌介导的丝状真菌的转化系统

1.3 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌种及载体

2.1.2 试剂及酶类

2.1.3 常用试剂的配制

2.1.4 培养基

2.1.5 仪器

2.2 试验方法

2.2.1 里氏木霉QM9414菌株的培养和菌种保存

2.2.2 里氏木霉DNA的提取

2.2.3 基因的克隆

2.2.4 敲除载体的构建

2.2.5 农杆菌感受态的制备和转化

2.2.6 农杆菌的处理和培养

2.2.7 农杆菌介导的里氏木霉的转化

2.2.8 转化子PCR的鉴定

2.2.9 转化子表型的鉴定

3 结果与分析

3.1 农杆菌介导的里氏木霉遗传转化体系的建立和优化

3.1.1 五氟乳氰酸（5-FOA）筛选浓度的测定

3.1.2 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响

3.1.3 孢子浓度对转化效率的影响

3.1.4 共培养时间对转化效率的影响

3.1.5 共培养温度对转化效率的影响

3.1.6 共培养中农杆菌初始浓度对转化效率的影响

3.2 △ura3缺陷型菌株的筛选

3.2.1 ura3基因的克隆

3.2.2 △ura3缺陷型载体的构建

3.2.3 △ura3缺陷型载体转化农杆菌

3.2.4 △ura3缺陷型菌株的筛选和鉴定

3.3 △ku70缺陷型菌株筛选

3.3.1 ku70基因的克隆

3.3.2 含黑曲霉pyrA基因的ku70基因的敲除载体的构建

3.3.3 △ku70敲除载体转化农杆菌

3.3.4 △ku70缺陷型菌株的筛选和鉴定

3.4 里氏木霉木糖苷酶xynd基因、bglI基因的敲除

3.4.1 xynd5、bglI3、xynII片段的克隆

3.4.2 xynd、bglI敲除载体的构建

3.4.3 xynd、bglI敲除载体转化农杆菌

3.4.4 xynd、bglI缺陷型菌株的筛选及鉴定

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文