IBV N基因和M基因原核表达及N蛋白间接ELISA方法的初步建立

摘要

鸡传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科（Coronariyidae），为不分节段的单股正链RNA病毒。N蛋白进化上最为保守，主要与基因组核酸的包裹、RNA的复制和细胞免疫有关，含有大量抗原决定簇，免疫原性仅次于S蛋白，能诱导机体产生大量抗体。M蛋白及其基因在进化中比较保守，M蛋白与病毒的复制有关，同时M蛋白可能是重要的免疫原基因。尽管目前对于IBV的免疫大多数研究都集中于S1蛋白，但IBV其它的结构蛋白，如N蛋白、M蛋白与S蛋白相比保守性更高，因此研究N蛋白和M蛋白对了解鸡传染性支气管炎的诊断和防制方面有很重要的现实意义。通过表达具有高度保守性的N蛋白，并将其作为诊断抗原建立检测IBV抗体的ELISA法，为监测群体的抗体水平，预防和控制该病提供可靠的依据和有效的技术保障。同时表达M蛋白以便为下一步研究该蛋白的免疫原性奠定基础。
　　 本研究根据GenBank已报道的IBV的M41株的N基因和M基因序列分别设计一对引物，从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术分别扩增获得了约1.23kb和678bp的片段，将这两个片段分别插入克隆载体pMD18-T，经测定核苷酸序列证实N基因和M基因都扩增正确，表明已成功构建pMD18-T-N和pMD18-T-M。再将pMD18-T-N和pMD18-T-M用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，将酶切后的N基因和M基因片段分别克隆到表达载体pET-32a中，分别转化入大肠杆菌Rossetta中，分别用IPTG诱导，进行SDS-PAGE电泳，电泳结果显示：其中N蛋白有了表达且为可溶性的蛋白，N蛋白有两种产物，大小分别约为63 kD和55kD，且Western blot检测可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应也出现两条带，表明表达的N蛋白有一定的生物活性；M蛋白也有表达，且也为可溶性的蛋白，条带约为30kD，Western blot检测可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应，说明表达的M蛋白有很好的免疫学活性。
　　 本研究在进行N蛋白的原核表达之后，用纯化的传染性支气管炎病毒（IBV）重组核蛋白（N蛋白）包被ELISA板，建立了检测IBV的间接ELISA方法，其中抗原的最佳包被浓度是1.80μg/ml，血清的最佳稀释度为1:80，二抗的最佳工作浓度为1:5000；统计学分析后确定阴阳性的临界值为0.351（X+3×SD=0.18+3×0.057）。该方法特异性好，与其它禽类病霉（NDV、IBDV、EDS76V、AIV）标准阳性血清均无交叉反应：进行批间批内重复试验的结果是变异系数均小于8％，表明具有良好的重复性；用IDEXX试剂盒与本实验所建立的间接ELISA方法进行了符合性实验，结果阳性符合率为92.3％，阴性符合率为97.1％，说明此ELISA方法具有一定的可靠性；将其初步应用于80份血清的检测，结果表明本方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点，可用于临床样品中IBV抗体的快速检测。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 发生和流行概况

1.2 IBV病原学特征

1.3 IBV基因组

1.4 IBV的主要结构蛋白及功能

1.4.1 纤突蛋白（S）

1.4.2 核衣壳蛋白（N）

1.4.3 膜蛋白（M）

1.4.4 小膜蛋白（E）

1.5 IB疫苗的研究进展

1.5.1 弱毒疫苗

1.5.2 灭活疫苗

1.5.3 基因工程疫苗

1.6 IB检测诊断方法的研究进展

1.6.1 IBV的分离培养鉴定

1.6.2 血清学检测技术

1.6.3 分子生物学检测技术

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 N基因和M基因原核表达的实验材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 重组N蛋白纯化及间接ELISA方法的初步建立的材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 IBV N基因和M基因RT-PCR结果

3.2 目的片段的克隆及鉴定

3.3 重组质粒鉴定

3.4 表达产物的SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定

3.5 表达产物的存在形式检测

3.6 间接ELISA方法的初步建立

3.6.1 棋盘滴定法选择抗原和血清的工作浓度

3.6.2 最佳封闭液的确定

3.6.3 最佳封闭时间的确定

3.6.4 酶标二抗最佳稀释度的确定

3.6.5 抗原抗体最佳作用时间试验

3.6.6 底物最佳作用时间的确定

3.6.7 阴阳性临界值的确定

3.6.8 特异性试验

3.6.9 重复性试验

3.6.10 符合性试验

3.6.11 临床样品的检测

3.6.12 保存期试验

4 讨论

4.1 对表达基因的选择

4.2 N基因和M基因的克隆

4.3 表达菌株的选择

4.4 感受态的制备方法

4.5 N基因和M基因的表达

4.6 表达产物存在形式的检测

4.7 重组N蛋白的纯化

4.8 检测方法的选择及其重要性

4.9 间接ELISA各项试验条件的优化

4.10 ELISA反应的特异性、重复性、符合性的检测

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文