IBVN蛋白原核表达及间接ELISA方法建立和初步应用

摘要

鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性、病毒性传染病。N基因在进化上相对保守，N蛋白是决定IBV抗原性的主要结构蛋白，可参与结合病毒的RNA，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。因此，研究N蛋白的生物学功能及特性对IB的诊断和防治具有重要的意义。通过诱导表达高度保守性的N蛋白，并利用其作为包被抗原，建立IBV抗体间接ELISA检测方法，为鸡群IBV抗体的监测、诊断和防制该病提供可靠的理论依据和有效的技术支持。 本试验根据NCBI发表的IBV基因序列设计了一对针对N基因完整开放阅读框的引物，利用RT-PCR方法扩增出1750 bp的目的条带，之后将目的片段连接pMD18-T克隆载体中。经测序证实N基因扩增正确后，再根据已测序获得的N基因序列设计一对亚克隆引物，利用PCR方法扩增获得1230 bp的目的片段，并将其插入到pET-30a(+)表达载体中，构建重组质粒pET-30a-N，经酶切、测序鉴定正确后转入到大肠杆菌Rossetta感受态细胞中，利用IPTG进行诱导表达，获得大小为51 kDa的可溶性N蛋白。Western-blot检测重组蛋白，能与IBV阳性血清有很好的反应性，表明所表达的N蛋白具有很好的生物活性。 将pET-30a-N重组蛋白经镍柱纯化后作为包被抗原，建立IBV抗体间接ELISA检测方法，并对所建立的间接ELISA方法的工作条件进行优化。结果表明，抗原的最佳包被浓度为2.5μg·mL-1，血清的最佳稀释度为1∶40，最佳封闭液为1％ BSA，最佳封闭时间为2h，二抗最佳稀释度为1∶1000，最佳底物显色时间为10 min。重复性试验和特异性试验结果表明，建立的间接ELISA检测方法具有很好的重复性和特异性，与禽白血病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等阳性血清均无交叉反应。采用建立的间接ELISA方法检测135份临床血清样本，与病毒作为包被抗原ELISA检测的结果有很高的符合率，为IB的快速诊断及流行病学研究提供了一个很好的工具。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 IB病原学

1．1．1 IBV基因组结构

1．1．2 IBV结构蛋白及生物学功能

1．2 IB流行病学

1．2．1 流行病学特点

1．2．2 分子流行病学特征

1．3 IB临床症状和病理变化

1．3．1 临床症状

1．3．2 病理变化

1．4 IB诊断技术

1．4．1 临床诊断

1．4．2 病毒分离

1．4．3 血清学诊断方法

1．4．4 分子生物学诊断方法

1．5 IB疫苗的研究进展

1．6 IB的防治

1．7 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒、菌株及鸡胚

2．1．2 病毒与血清

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要试剂的配制

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 引物的设计与合成

2．2．2 IBV HH06株N基因的克隆

2．2．3 IBV HH06株N蛋白原核表达与生物活性分析

2．2．4 IBV HH06株N蛋白多克隆抗体的制备及其生物活性检测

2．2．5 IBV HH06株N蛋白间接ELISA方法的建立

2．2．6 间接ELISA方法特异性试验

2．2．7 间接ELISA方法重复性试验

2．2．8 间接ELISA方法敏感性试验

2．2．9 间接ELISA方法检测临床样本

3 结果

3．1 IBV HH06株N基因的克隆与鉴定

3．1．1 RT-PCR扩增N基因

3．1．2 重组质粒pMD18-T-N的鉴定

3．1．3 pMD18-T-N序列测定及分析

3．2 IBV HH06株N蛋白原核表达

3．2．1 扩增目的片段N基因

3．2．2 重组质粒pET-30a-N的鉴定

3．2．3 表达产物SDS-PAGE的鉴定

3．2．4 表达产物的Western-blot鉴定

3．3 IBV HH06株N蛋白多克隆抗体的制备及其鉴定

3．3．1 多克隆抗体的间接ELISA检测和Western-blot检测

3．3．2 多克隆抗体的IFA检测

3．4 间接ELISA方法的建立

3．4．1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度的确定

3．4．2 最佳封闭液的选择和时间的确定

3．4．3 最佳血清孵育时间的确定

3．4．4 HRP标记羊抗鸡IgG(二抗)最佳稀释度和时间的确定

3．4．5 最佳底物显色时间的确定

3．4．6 临界值确定

3．4．7 重复性试验

3．4．8 特异性试验

3．4．9 敏感性试验

3．4．10 临床样品检测

4 讨论

4．1 IBV HH06株N基因的克隆与序列分析

4．2 IBV HH06株N蛋白的诱导表达

4．2．1 pET-30a(+)表达载体的选择

4．2．2 重组N蛋白的表达及纯化

4．3 间接ELISA方法的建立

4．3．1 N蛋白的选择

4．3．2 间接ELISA检测方法各项条件的优化

4．3．3 建立间接ELISA诊断方法的特性

5 结论

致谢

参考文献

攻读专业硕士学位期间发表的学术论文