大豆胰蛋白酶抑制剂提取及酶法失活技术研究

摘要

大豆富含蛋白质,是非常有价值的食源性植物蛋白质。大豆中的异黄酮,磷脂等多种成分对人类都有医疗保健作用。大豆既是重要的粮食作物,又是主要的油料作物,还可以作为畜禽饲料以及食品和轻工业原料,在医学上也有重要意义,对人类的营养与健康、畜牧业的发展均起到了重要作用。然而大豆中含有多种抗营养因子,如胰蛋白酶抑制剂,严重影响了营养的吸收,造成大豆制品品质上的缺陷,甚至危害人类的身体健康。研究发现,大豆胰蛋白酶抑制剂还是一种良好的保健品,在抗肿瘤方面具有潜在的应用价值,微量胰蛋白酶抑制剂对于治疗糖尿病,调节胰岛素失调可能有一定效果。因此,研究大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯具有一定的理论与现实意义。
　　 当前,去除大豆胰蛋白酶抑制剂的方法中对热处理的研究较多,但热处理也存在缺陷,如长时间高热会降低大豆蛋白质的营养价值,且一些抗营养因子抗热性还很强,不能够使其完全失活。基于胰蛋白酶抑制剂是蛋白质,因此采用蛋白酶失活的方法将会是很有发展前景的方法。
　　 本课题主要研究了大豆胰蛋白酶抑制剂的粗提,超滤条件的确定,响应面法对粗提工艺进行优化,大豆胰蛋白酶抑制剂的精提,电泳对提取结果进行检测,蛋白酶的选取,碱性蛋白酶酶解大豆胰蛋白酶抑制剂单因素试验确定反应条件,响应面试验确定碱性蛋白酶酶解大豆胰蛋白酶抑制剂最佳工艺条件。
　　 1)对大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)提取的研究,以大豆胰蛋白酶抑制剂提取率为考察指标,以提取液pH值、热变性温度和硫酸铵饱和度作为影响大豆胰蛋白酶抑制剂提取率的因素,通过单因素试验确定了比较适宜的粗提条件:pH值4.5～5.5、温度60～80℃、硫酸铵饱和度50～60％。通过响应面试验确定大豆胰蛋白酶抑制剂提取的最佳工艺条件为提取液pH5.1、热变性温度72.8℃、硫酸铵饱和度54.5％。在此工艺条件下,大豆胰蛋白酶抑制剂的提取率达到86％。
　　 2)超滤条件的确定
　　 在现有实验条件下,选择切割分子量为5000Da的超滤膜。在此条件下,确定了操作压力为1.5bar,操作温度为30℃,并且在操作40min左右对超滤膜进行清洗。
　　 3)STI的精提
　　 采用DEAE-52离子交换柱层析,SephadexG-75分子筛凝胶过滤柱层析各一次,通过BAPNA法检测其各峰是否有活性,根据标准曲线确定其分子量,有活性的峰与标品的出峰时间对比确定了KTI和BBI。
　　 4)酶解蛋白酶的选择
　　 以蛋白酶水解大豆胰蛋白酶抑制剂钝化率作为参考指标,综合考虑酶的专一性、作用机制、安全性、经济性、有效性,最终选择碱性蛋白酶水解STI。
　　 5)最佳酶解条件的确定
　　 以碱性蛋白酶钝化大豆胰蛋白酶抑制剂的钝化率为考察指标,以反应温度、反应时间、酶添加量和pH值作为影响钝化率的因素,通过单因素试验确定了比较适宜的酶解条件:即反应温度30～70℃、反应时间40～120min、酶添加量20000～40000u/mL、pH值7～11。采用二次回归正交旋转组合响应面分析法得出最佳条件:即反应温度53.13℃,pH9.11,酶添加量41754.75u/mL,反应时间90.65min,进行3次平行实验,所得碱性蛋白酶酶解大豆胰蛋白酶抑制剂钝化率3次试验的平均值为94.47％。