冰城链霉菌C5-酮基属间接合转移中断菌株的构建

摘要

米尔贝霉素具有广谱、高效的抗寄生虫活性，对宿主不良反应极低，是目前理想的驱虫、杀虫药物。其C5-肟米尔贝霉素的活性更高，并且杀虫谱更广，效果更好。而5-酮基米尔贝霉素由于其C5位酮基的化学性质比较活泼，很容易合成5-肟米尔贝素衍生物，是化学合成5-肟米尔贝霉素衍生物的最佳前体，因此研究从米尔贝霉素A3、A4到5-酮基米尔贝霉素A3、A4的生物合成途径具有重要的意义。冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是本实验室发现的一株新的吸水链霉菌菌株，是米尔贝霉素(milbemycin)和冰城霉素(bingchengmycin)的重要产生菌。冰城链霉菌的代谢产物具有较好的杀虫活性和高效防治能力。接合转移作为基因转移工具已在多种链霉菌中成功应用，此方法既可以避开胞外核酸酶使DNA免遭降解，在一定程度上还可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰提高转化效率。binF基因(C5-酮基还原酶基因)是在冰城链霉菌中负责编码催化大环内酯类抗生素C5位的酮基转化为羟基的还原酶基因，序列较保守。
　　 本研究通过分子生物学的方法对binF基因进行失活，从而获得产生C5-酮基米尔贝霉素的生产菌株。以冰城链霉菌226541为研究材料，进行了大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移系统的实验，尝试了冰城链霉菌中binF基因的中断工作。为了进一步研究binF基因在冰城链霉菌226541中的功能，本研究利用生物信息学分析冰城链霉菌的基因组信息，确定binF基因位置及相邻序列，设计引物binF-L1、binF-L2和binF-R1、binF-R2，在冰城链霉菌226541总DNA中扩增binF基因的两翼序列，与pMD19-TVector连接构建出质粒 pBC1130，在两翼中间插入硫链丝菌素抗性基因(tsr)构建出质粒pBC810。然后利用HindⅢ和BamHⅠ酶切两翼，与pKC1139连接构建中断质粒pBC3129，并用 PCR和测序比对验证了中断质粒构建的正确性。将binF中断质粒pBC3129转入ET12567(PUZ8002)获得接合转移供体菌ET12567(pUZ8002/pBC3129)，通过接合转移导入冰城链霉菌226541中，得到阳性接合子。对接合子进行抗生素稳定性和分子生物学筛选，最终得到binF基因中断菌株。冰城链霉菌226541与大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pBC3129)的接合转移体系为：冰城链霉菌226541孢子28℃孵育30 min，大肠杆菌OD600值为0.2，混合涂布于含有30 mM MgCl2的MS培养基上，培养16h覆盖抗生素。