流产布鲁氏菌Omp25与L7/L12促巨噬细胞凋亡的分子机制

摘要

布鲁氏菌病(简称布病)是国际公认的自然疫源性疾病，可以在动物群体中自然携带与传播。布病以人、牛、羊、猪最为常见，犬及60多种家畜、家禽及野生动物对布病都有不同程度的易感性。布病流行范围很广，全世界200多个国家和地区中有170多个国家和地区有人及家畜布病的存在。全世界每年因布病造成的经济损失可高达30亿美元。在我国，仅新疆和青海两地每年布病导致的经济损失近1亿元。
　　 巨噬细胞是天然免疫的第一道防线，是布鲁氏菌在体内复制的主要侵染细胞。对于布鲁氏菌的存活和扩散起着非常重要的作用。在布鲁氏菌感染的早期，巨噬细胞有可能先通过降解布鲁氏菌并提呈布鲁氏菌抗原来启动免疫应答，一旦此途径受阻，感染的巨噬细胞便可能通过启动凋亡信号使布鲁氏菌失去巨噬细胞提供的保护环境，便于机体将其清除。而事实上，布鲁氏菌能在宿主细胞内复制并且积极维护细胞免于发生凋亡。由此可见，诱导巨噬细胞发生凋亡对布鲁氏菌的感染清除有着重要的意义。
　　 有研究发现巨噬细胞功能的调节和细胞因子的分泌与革兰氏阴性菌的菌体蛋白有关。布鲁氏菌外膜蛋白Omp25能调节TNF-α的产生，而TNF-α的产生能够限制或清除巨噬细胞内的细菌；L7/L12蛋白是布鲁氏菌的核糖体蛋白，能促进γ干扰素(IFN-γ)的转录和表达，而IFN-γ表达上调与巨噬细胞凋亡直接相关。因此，本研究以Omp25、L7/L12为靶蛋白，体外研究Omp25、L7/L12蛋白对巨噬细胞凋亡的影响。
　　 本研究克隆出流产型布鲁氏菌omp25基因和L7/L12基因。将omp25连入原核表达载体pGEX-6p-1，L7/L12连入原核表达载体pET28a-SUMO，表达重组蛋白pGEX-6p-omp25和pET28a-SUMO-L7/L12。制备鼠抗Omp25多克隆抗体和兔抗L7/L12多克隆抗体。将omp25和L7/L12分别插入转移载体pFastBacHTB的多克隆位点，构建杆状病毒重组转移载体在昆虫细胞(sf9)中表达。
　　 蛋白体外作用巨噬细胞，对巨噬细胞的吞噬活性、分泌的细胞因子、促细胞凋亡方面进行了检测。结果：
　　 1)Omp25和L7/L12对巨噬细胞吞噬活性的影响
　　 巨噬细胞分别负载Omp25和L7/L12后，吞噬活性与静息状态相比差异显著(P<0.01)，与阴性对照相比，差异显著(P<0.01)，Omp25与LPS协同作用后，巨噬细胞吞噬活性显著提高，与巨噬细胞负载Omp25后的吞噬活性相比，差异显著(P<0.01)；L7/L12与LPS协同作用后，巨噬细胞吞噬活性显著提高，与巨噬细胞负载L7/L12后的吞噬活性相比，差异显著(P<0.01)。
　　 2)Omp25和L7/L12对巨噬细胞分泌细胞因子的影响
　　 巨噬细胞负载Omp25后，从6h开始，检测到IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的分泌，到12hIL-6分泌达到最大值，到48h IL-1β、IL-8、IL-10的分泌达到最大值，与阴性对照相比差异显著(P<0.01)；与LPS协同作用巨噬细胞后，分泌的细胞因子均提高，与LPS相比，差异显著(P<0.01)，与阴性对照相比，差异显著(P<0.01)，多克隆抗体阻断后，各细胞因子分泌量均下降，与未阻断组相比，差异显著(P<0.01)。
　　 巨噬细胞负载L7/L12后，从6h开始，检测到IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的分泌，到12hIL-6分泌达到最大值，到48h IL-1β、IL-8、IL-10的分泌达到最大值，与阴性对照相比差异显著(P<0.01)；与LPS协同作用巨噬细胞后，分泌的细胞因子均提高，与LPS相比，差异显著(P<0.01)，与阴性对照相比，差异显著(P<0.01)，多克隆抗体阻断后，各细胞因子分泌量均下降，与未阻断组相比，差异显著(P<0.01)。
　　 3)Omp25和L7/L12对巨噬细胞凋亡的影响
　　 巨噬细胞负载Omp25后，可刺激巨噬细胞产少量的caspase-3，与LPS协同刺激后可产生较多的caspase-3；巨噬细胞负载Omp25未能有典型的凋亡小体产生，但Omp25与LPS协同作用可产生典型的凋亡小体；对负载Omp25后的巨噬细胞染色发现，巨噬细胞负载Omp25后细胞有蓝色荧光，并且强于对照组细胞。Omp25与LPS协同刺激后出现强蓝色荧光。
　　 Omp25作用巨噬细胞能促进由LPS刺激引起的巨噬细胞分泌的TNF-α的增加。Omp25能促进由LPS激活引起的NF-κB核转位。当omp25与P38 MAPK信号转导抑制剂SB203580作用后NF-κB未被激活；当多克隆抗体对omp25进行阻断后，NF-κB未被激活。
　　 巨噬负载细胞L7/L12后，可刺激巨噬细胞产生微量的caspase-3，与LPS协同刺激后可产生少量的caspase-3，巨噬细胞负载L7/L12后未能有典型的凋亡小体产生，但L7/L12与LPS协同作用可产生典型的凋亡小体；对负载L7/L12后的巨噬细胞染色发现，巨噬细胞负载L7/L12后细胞有蓝色荧光。L7/L12与LPS协同刺激后出现强蓝色荧光。
　　 L7/L12作用巨噬细胞能促进由LPS刺激引起的巨噬细胞分泌的TNF-α的增加。L7/L12能促进由LPS激活引起的NF-κB核转位，当L7/L12与P38 MAPK信号转导抑制剂SB203580作用后NF-κB未被激活；当多克隆抗体对L7/L12进行阻断后，NF-κB未被激活。
　　 本研究通过以上试验得出：
　　 1)Omp25与L7/L12可激活巨噬细胞，提高巨噬细胞的吞噬活性，增强杀菌能力，促进巨噬细胞对病原菌的清除：
　　 2)Omp25与L7/L12可体外增强巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8的含量。
　　 3)Omp25与L7/L12诱导巨噬细胞分泌caspase-3，上调TNF-α的分泌。激活NF-κB，促进由LPS诱导的巨噬细胞的凋亡。