猪印记基因的生物信息学预测、克隆与初步鉴定

摘要

在哺乳动物的组织或细胞中，某些等位基因不遵循传统的孟德尔遗传规律，表现为单等位基因表达，这些基因的其表达具有亲源特异性，即只表达来自父源或母源的等位基因，这类基因称为印记基因。印记基因的本质特征是亲源特异性单等位基因表达，此外印记基因还具有成簇分布的特性，在基因组中通常成簇存在；每个印记基因簇中都含有至少一个长非编码RNA和几个差异甲基化区域，二者对印记基因的表达具有调控作用；印记基因的表达具有时空特异性，可以在发育的不同阶段或是不同组织中，表现出不同的印记状态；大部分印记基因在哺乳动物中具有相同的印记状态，呈现出物种的保守性。基因功能研究表明，印记基因在哺乳动物的生长发育过程中具有重要作用，尤其表现在对胎盘发育和个体发育的影响上。印记基因的异常表达，会导致如生长过剩综合征、侏儒症等多种生长发育相关的疾病。在体细胞克隆中，印记基因的异常表达，以及印记基因印记控制区(ICR)的甲基化异常，是造成克隆动物发育异常、流产率高的一个重要原因。目前为止，印记基因的研究主要集中在小鼠和人上，小鼠中发现的印记基因多达144个，人上为70余个，并对其中许多基因进行了功能研究和印记控制区寻找等深入的研究工作。而在猪上，目前已验证的印记基因仅有十余个，其中具有明确印记控制区(ICR)信息的只有Igf2/H19印记区。因此，在猪上对印记基因进行生物信息学预测，并对预测得到的候选基因进行克隆和印记鉴定具有重要的意义。
　　 本研究根据印记基因在哺乳动物中具有较高保守性这一特征，利用生物信息学方法，将小鼠的印记基因序列与猪的基因组数据进行序列比对分析，对印记基因进行预测，筛选获得候选印记基因；然后对与胚胎发育相关的候选基因进行分子克隆，获得其全长序列；最后选择一个基因，使用“基于cSNP印记验证方法”，对印记基因的鉴定方法进行初步的探索。主要研究结果如下：⑴在linux系统下，应用Blast本地比对方法，将小鼠的印记基因序列与猪Refseq数据和Unigene数据构成的数据库进行比对，编写程序对比对结果进行解析，获得了59个候选印记基因，参照猪已知印记基因，本实验预测结果具有较高可信度。⑵通过RT-PCR方法，从猪成纤维细胞提取的RNA中，克隆获得四个候选基因Asb4、Snrpn、Cd81、Grb10的全长序列。⑶使用“基于cSNP印记验证方法”，对Asb4基因的印记状态进行初步鉴定。在大白公猪和长白母猪Asb4第五个外显子77bp处发现A→G突变，确定为一个cSNP位点；在其杂交子代F1中，新生猪的脐带和耳部组织中，该cSNP位点测序出现双峰，为双等位基因表达，一月龄小猪的16个不同组织中，该cSNP位点测序依然全部为双峰；表明基因Asb4在猪上不具备印记表达特性，不是印记基因。