勃利霉素对卵菌抑制作用机理研究

摘要

卵菌包含许多严重危害农作物的病原菌，例如大豆疫霉、致病疫霉等。大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是一种危害极为严重的世界性大豆病害之一。卵菌病害的防治主要采用化学杀菌剂，甲霜灵(Metalay)作为防治卵菌病害的特效药，目前抗性问题日益严重。因此，研发出更为有效的的生物源杀卵菌剂已是刻不容缓。由链霉菌产生的大环内酯类化合物勃利霉素高效抑制大豆疫霉菌丝生长。勃利霉素对大豆疫霉抑制作用的分子机制还有待深入研究。
　　 本研究利用苏氨酸体外添加实验初步确定了勃利霉素对大豆疫霉抑制作用的分子靶标为大豆疫霉的细胞质苏氨酰-tRNA合成酶(threonyl-tRNA synthetase，ThrRS)，并通过体外酶活测定、荧光光谱分析和停留光谱等全面分析了勃利霉素对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的抑制作用机理。除此之外，利用生物信息学分析进一步预测了勃利霉素可能对大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶具有抑制作用。结果如下:
　　 (1)在含勃利霉素的大豆疫霉胡萝卜琼脂(carrot agar medium，CA)培养基中添加苏氨酸，可以明显缓解勃利霉素对大豆疫霉优势小种1菌丝生长的抑制作用，苏氨酸与勃利霉素对大豆疫霉菌丝生长抑制作用之间存在剂量关系，即随着苏氨酸的浓度增加，勃利霉素对大豆疫霉菌丝生长抑制作用减弱，这种现象在其它对照氨基酸中没有观察到，因此可以根据苏氨酸与勃利霉素对大豆疫霉菌丝生长抑制作用之间的剂量效应初步确定勃利霉素对大豆疫霉抑制作用的靶标为苏氨酰-tRNA合成酶。
　　 (2)利用生物信息学分析在大豆疫霉基因组内确定其细胞质苏氨酰-tRNA合成酶为勃利霉素作用靶标。利用基因组PCR扩增技术获得大豆疫霉优势小种1的细胞质苏氨酰-tRNA合成酶基因，利用基因工程技术将其克隆到pET-32a(+)表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行体外表达。利用低温诱导和镍柱纯化获得了可溶性的大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶。
　　 (3)建立了非放射性方法测定苏氨酰-tRNA合成酶催化苏氨酸活化反应的催化活性:通过离心去除结合到凝胶上的反应生成物ThrRS·Thr～AMP复合物，反应液上清中的底物苏氨酸利用氨基酸衍生法和高效液相色谱技术进行检测，由此计算苏氨酸活化反应中生成物的量来测定勃利霉素对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的酶活性抑制的IC50。勃利霉素对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的酶活性的抑制常数K(app)为10μM，IC50为8μM，实验测定所用的酶浓度为4μM。由此可见，勃利霉素对大豆疫霉的抑制作用是由抑制大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶催化反应引起的。
　　 (4)为进一步明确勃利霉素对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的抑制作用机制，利用光谱技术研究勃利霉素与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的相互作用，揭示其结合特性。结果表明勃利霉素对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的荧光猝灭为静态猝灭，其在大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶上有一个结合位点。两者有较强的结合亲和性，结合常数(binding constant) KA为2.552×105 M-1。热力学常数△G＜0，△H=85.024 kJ mol-1，△S=0.372 kJ mol-1K-1，这说明勃利霉素与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的结合反应是一个自发的过程，主要作用力是疏水作用力。根据F(o)rster非辐射能量转移理论，勃利霉素与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的结合距离为6.39 nm。因此，勃利霉素通过与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶形成复合体发挥其抑制作用。
　　 (5)利用圆二色光谱法研究勃利霉素与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶结合前后，蛋白质微环境及构型的改变。结果表明，勃利霉素与苏氨酰-tRNA合成酶结合导致α-螺旋含量升高，β-折叠含量下降，两者同时发生变化。苏氨酰-tRNA合成酶属于α+β蛋白，由此可知，勃利霉素在与苏氨酰-tRNA合成酶形成复合体的过程中，对其二级结构有较大影响，可能结合在其催化活性位点区域。为进一步确定勃利霉素在大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶结合位点与底物结合位点的关系，利用圆二色滴定检测勃利霉素在底物存在下对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶二级结构的影响。结果表明，底物的结合位点与勃利霉素的结合位点并不重叠，勃利霉素是大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶非竞争性抑制剂。
　　 (6)利用停留光谱进一步对勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶结合的前稳态动力学特征进行了分析。结果表明，勃利霉素与大豆疫霉苏氨酰-tRNA合成酶快速结合动力学参数kon为4.381×106 M-1 s-1，Kd为22.8 nM，勃利霉素与致病疫菌苏氨酰-tRNA合成酶kon为4.612×106 M-1 s-1，Kd为21.7 nM，接近于勃利霉素对大肠杆菌快速结合动力学参数值(kon=5×106 M-1 s-1，Kd＜20 nM)。底物存在情况下，勃利霉素与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶快速结合仍检测到明显的荧光猝灭作用，进一步说明底物与勃利霉素在大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶具有不同的结合位点，勃利霉素为大豆疫霉苏氨酰-tRNA合成酶的非竞争性抑制剂。
　　 (7)多序列比对分析揭示，大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶与大肠杆菌苏氨酰-tRNA合成酶具有较高的相似性，大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶勃利霉素结合的疏水区(Set-410，His-412，Cys-437，Pro-438，Leu-593，Phe-597)与预测的大肠杆菌苏氨酰-tRNA合成酶勃利霉素结合区是保守的。利用CA STp-pocket/cavity程序预测了大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的勃利霉素可能的结合口袋，结果表明大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶与大肠杆菌苏氨酰-tRNA合成酶勃利霉素口袋的氨基酸组成类似，在口袋的体积和面积上有一定差异，大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的勃利霉素结合口袋稍大，可能有利于勃利霉素的结合，提高了大豆疫霉对勃利霉素的敏感性。
　　 (8)作为细胞周期抑制剂，勃利霉素可能对大豆疫霉的细胞周期相关蛋白具有抑制作用。利用序列比对分析、系统进化分析和保守区域分析等预测了与酵母细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdc28高度同源的大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2，为进一步深入研究勃利霉素对大豆疫霉细胞周期相关蛋白的抑制作用机理奠定了基础。
　　 综上所述，本研究从分子水平上阐明了勃利霉素对大豆疫霉菌丝生长抑制作用的机理，并全面分析了勃利霉素与大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的结合特性、抑制类型以及两者结合对酶构型变化的影响，并对勃利霉索在大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的结合位点进行了预测。我们提出了勃利霉素可能对大豆疫霉细胞周期蛋白有抑制作用，预测了其作用靶标。研究所取得的结果为将勃利霉素开发为新型抗卵菌剂提供了理论基础，对于卵菌病害的防治具有重要意义。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物卵菌病害及防治

1．2 微生物代谢产物与生物农药

1．3 勃利霉素及作用机理研究

1．3．1 勃利霉素及其生物活性

1．3．2 勃利霉素作用机理研究

1．3．3 氨酰tRNA合成酶及其功能

1．4 卵菌基因组学研究

1．4．1 卵菌基因组学研究进展

1．4．2 生物信息学在卵菌基因组研究中的应用

1．5 生物大分子与小分子相互作用的研究方法

1．5．1 光谱分析技术

1．5．2 圆二色及停留光谱技术

1．6 研究的目的和内容

1．6．1 研究的目的和意义

1．6．2 课题来源和研究内容

2 材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．1．1 主要试剂及生产厂家

2．1．2 菌种与质粒

2．1．3 主要培养基及溶液

2．1．4 仪器

2．2 borrelidin对大豆疫霉生长抑制作用靶标的确定

2．2．1 borrelidin对大豆疫霉生长抑制作用

2．2．2 体外苏氨酸添加实验确定勃利霉素作用靶标

2．3 大豆疫霉苏氨酰tRNA合成酶的克隆及勃利霉素对其活性抑制作用研究

2．3．1 大豆疫霉基因组内苏氨酰-tRNA合成酶的生物信息学分析

2．3．2 大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的基因克隆与重组蛋白体外表达

2．3．3 勃利霉素对苏氨酰-tRNA合成酶活性的抑制作用

2．4 疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶与勃利霉素相互作用的光谱分析

2．4．1 勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶荧光光谱检测

2．4．2 勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶紫外光谱检测

2．4．3 疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶与勃利霉素结合的圆二色光谱

2．5 勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶结合的前稳态动力学特征分析

2．6 勃利霉素在大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶结合位点的预测分析

2．7 大豆疫霉基因组内勃利霉素潜在作用靶标CDK生物信息分析

3 结果与讨论

3．1 勃利霉素对大豆疫霉菌丝生长及孢子萌发的抑制作用

3．2 体外苏氨酸添加实验确定勃利霉素作用靶标

3．3 大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的基因克隆

3．4 勃利霉素对大豆疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶氨基酸活化反应的抑制作用

3．5 疫霉苏氨酰-tRNA合成酶与勃利霉素相互作用

3．5．1 勃利霉素对疫霉苏氨酰-tRNA合成酶的荧光猝灭

3．5．2 勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶的结合常数和结合位点数目

3．5．3 勃利霉素与疫霉苏氨酰-tRNA合成酶结合的热力学参数及作用力类型

3．5．4 勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶之间的能量转移

3．5．5 勃利霉素结合对疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶二级结构的影响

3．6 勃利霉素与疫霉细胞质苏氨酰-tRNA合成酶结合的前稳态动力学特征

3．7 勃利霉素在大豆疫霉苏氨酰-tRNA合成酶结合位点及结合口袋的预测分析

3．8 大豆疫霉基因组细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK

4 结论

致谢

参考文献

附录A：附表

附录B：附图

附录C：缩略词

攻读博士期间发表的学术论文