勃利霉素与靶酶ThrRS的作用位点及其抑制剂的虚拟筛选

摘要

大豆疫霉（Phytophthora sojae，简写P.sojae）属卵菌纲真菌，是存在于土壤当中的植物病原菌，能够引起大豆植株茎和根的腐烂，该病是大多数大豆种植区都比较普遍的疾病之一，会引起大豆大量减产。为了鉴定勃利霉素与PsThrRS的结合位点，以便通过虚拟筛选技术发现更多对PsThrRS选择性更高、活性更好的先导化合物，从而防治大豆疫霉引起的各种疾病，本研究首先利用分子对接技术和定点突变技术相结合的方法研究了勃利霉素与大肠杆菌苏氨酰tRNA合成酶(EThrRS)的结合位点;接着利用同源建模首次建立了PsThrRS的三维结构;鉴于分子对接预测勃利霉素与EThrRS结合位点的准确性，再次利用分子对接预测了勃利霉素与PsThrRS的结合位点。为了发现勃利霉素与PsThrRS结合更为重要的氨基酸残基，对PsThrRS涉及勃利霉素结合的每一个氨基酸残基都进行了虚拟点突变，并通过分子对接比较了突变后勃利霉素与PsThrRS突变体结合自由能的变化。最后，为了得到PsThrRS抑制剂的候选化合物，分别进行了基于分子对接和基于药效团模型两种方法的虚拟筛选。得到的结果如下:
　　1)勃利霉素与EThrRS的结合位点的研究
　　首先分别从PDB的网站上和NCBI化合物数据库中获取了EThrRS和勃利霉素的三维结构的文件，然后利用计算机分子对接技术通过AutoDock Vina软件将勃利霉素与EThrRS的活性中心进行对接。结果表明，所有与勃利霉素结合相关的氨基酸残基都处在与活性中心相邻的外侧，它们由氨基酸残基Y313、R363、R375、P424、E458、G459和K465组成。值得注意的是，勃利霉素的结合自由能(-9.1kcal/mol)高于ATP的结合自由能(-9.6kcal/mol)，说明ATP的结合比勃利霉素更加容易。这表明ATP先于勃利霉素与EThrRS结合，且ATP处在比勃利霉素更加深入的EThrRS的活性中心。所以，我们推测勃利霉素并不阻止ATP和苏氨酸与ThrRS的结合，而是通过诱导口袋关闭阻止Thr-AMP和PPi的释放。为了找到与勃利霉素结合更加重要的氨基酸残基，通过将EThrRS的蛋白序列与分别来自勃利霉素敏感(S.solfataricus和P.sojae)和勃利霉素抗性物种（M.jannaschii和A.fulgidus）的ThrRS的蛋白序列进行多序列比对。结果表明Y313、P424、E458、G459可能对勃利霉素的结合更加重要，这些残基的任何改变都可能影响ThrRS对勃利霉素的敏感性。为了验证计算机预测结果的准确性，通过定点突变技术被分别构建ThrRS突变体P424K、E458△和G459△(Y313已被报道涉及勃利霉素的结合)。然后，通过高效液相色谱(HPLC)测定它们的酶动力学参数（如kcat和Km）进而比较它们与野生型EThrRS的酶活差异。之后，由酶抑制试验测得Ki值，以比较野生型EThrRS与突变体对勃利霉素亲和力的差异。并通过圆二色光谱比较了野生型EThrRS与突变体的结构。最后，运用荧光停留比较了野生型EThrRS与突变体表观速率常数(Kapp)的差异。圆二色光谱的结果表明突变体P424K、E458△、G459△的二级结构较野生型ThrRS并未发生变化。酶活实验表明，突变体的酶活性与野生型EThrRS相比差异并不显著，然而，它们与勃利霉素的亲和力和表观速率常数均有下降。这说明Y313、P424、E458、G459确实对勃利霉素结合EThrRS具有更为重要的作用。
　　2) PsThrRS三维结构的研究
　　首先比较了PsThrRS与PDB中现有ThrRS的蛋白序列，比对结果表明PsThrRS的氨基酸残基1-76与95-152分别和人类ThrRS(PDB ID:4HWT)的氨基酸残基371-445及462-525同源性较高，而PsThrRS的氨基酸残基72-110与147-744分别和EThrRS(PDB ID:1QF6)的氨基酸残基4-41及42-642同源性较高。所以，人类ThrRS和EThrRS的对应三维结构被用作模板。利用同源建模的方法，通过Modeller9.10软件，使用“非常快速动力学优化”参数构建了1000个PsThrRS的三维结构。接着，利用Modeller9.10软件自带的评估程序从这1000模型中选取了最好的10个，然后通过MolProbity3.15程序评估这10个模型，从而综合选出1个最优模型。由于模型393包含的键角、键长、原子重叠和phi/psi角的错误最少，该模型被选为最优模型。模型393的拉曼图显示95.96％(711/742)的氨基酸残基都处在合适的区域，99.7％(740/742)的氨基酸残基处在可接受区域。模型393中仅有2个氨基酸残基处在不可接受区域。这些结果说明构建的模型393是比较可靠的。为了发现PsThrRS潜在的结合位点，利用gromacs5.0对模型393进行了20ns的分子动力学模拟，结果发现PsThrRS未含有更多的勃利霉素结合位点，说明勃利霉素与PsThrRS的结合位点很可能与EThrRS对应相似。
　　3)勃利霉素与PsThrRS的结合位点的研究
　　首先通过计算机分子对接技术利用AutoDock Vina软件将勃利霉素与PsThrRS的活性中心进行对接。接着通过Discovery Studio Viewer3.5查找得到勃利霉素周围5(A)以内的所有氨基酸残基作为候选残基。结果发现在PsThrRS上距勃利霉素5(A)以内的氨基酸残基有His-412、Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Arg-478、Gln-484、Asp-486、Ala-564、 Tyr-566、 Lys-569、Gln-583、Thr-586、Gln-588和His-616。然后，通过同源建模，利用Modeller9.10软件将上述所有的候选残基分别虚拟点突变为与原来氨基酸不同的其它19个氨基酸，并利用AutoDock Vina软件分别与勃利霉素进行分子对接，计算每个点突变后的最大结合自由能、最小结合自由能，以确定每个点突变后可以波动的范围。波动范围越大，该残基越重要。分子对接的结果表明，勃利霉素与PsThrRS的结合位点和EThrRS上的结合位点相似，也位于邻近PsThrRS活性位点的外侧，所以作用机制也应该相同。氨基酸序列比对、虚拟点突变和分子对接预测表明，其中Tyr-416、Met-435、Cys-437、Arg-466、Gln-484、Asp-486、Gln-583、Thr-586、Gln-588、His-616、Ala-618对接得分的波动值均不小于1.5kcal/mol，说明这些氨基酸残基对勃利霉素与PsThrRS结合更为重要。
　　4)基于PsThrRS三维结构的虚拟筛选
　　基于与勃利霉素至少50％结构类似的标准进行筛选，从ZINC数据库的3500多万小分子中筛选出来2141个勃利霉素衍生物。然后，通过将这些化合物分别与P.sojae ThrRS进行分子对接，得到结合自由能低于勃利霉素的小分子23个。为了明确化合物结构与结合自由能的关系，将2141个小分子化合物按照与PsThrRS结合自由能的大小进行排序，从中随机选取结合自由能不同的化合物各一个，共32个化合物，通过Discovery Studio3.5建立药效团模型。由于Hypo1具有最高的消耗差异(116.338)、最佳的相关系数(0.992)和最低的根均方差(0.325807)，将其确定为最佳模型。这也表明Hypo1具有较好的预测能力。利用模型Hypo1再次筛选上述的2141个小分子化合物，先前的23个高亲和力化合物再次被筛选出来，但所用筛选时间仅大约为35 min，约为先前相同计算机配置上利用AutoDock Vina筛选所耗时间（约60 h）的1/100。说明利用药效团模型筛选药物库的速度要远高于分子对接的速度。于是利用Hypo1对Drugbank全数据库（共计6858个小分子）进行了虚拟筛选，得到匹配结果10个。再次利用AutoDock Vina对这10个配体分别进行对接验证，发现其中6个配体的结合能小于勃利霉素，且与之前的23个化合物结构并不相同。由此可知，利用药效团模型Hypo1对Drugbank全数据库筛选得到的PsThrRS抑制剂的准确率大约为60％(6/10)。我们从6858个小分子中筛选PsThrRS的抑制剂，得到的抑制剂数量却不如从2141个勃利霉素结构类似物筛选得到的数量多。这说明利用勃利霉素为先导化合物搜索ZINC中的勃利霉素结构类似物的确起到了PsThrRS抑制剂的初步富集作用，说明勃利霉素能够较好的抑制PsThrRS，与其特异的结构有关。
　　综上所述，本研究利用生物信息学和分子生物学相结合的方法探索了勃利霉素与EThrRS的结合位点;通过同源建模的方法首次建立了PsThrRS的三维结构;利用分子动力学模拟、虚拟点突变以及分子对接技术相结合的方法探索了勃利霉素与PsThrRS的结合位点;最后通过两种虚拟筛选技术找到了PsThrRS的潜在抑制剂，为大豆疫霉的控制奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大豆疫霉病害及控制

1．2 勃利霉素的研究进展

1．2．1 勃利霉素的简介

1．2．2 勃利霉素的生物活性

1．3 苏氨酰tRNA合成酶的研究进展

1．3．1 苏氨酰tRNA合成酶的生物化学鉴定

1．3．2 ThrRS的结构

1．4 分子对接的研究进展

1．4．1 对接理论

1．4．2 对接方法学

1．5 蛋白三维结构预测的研究进展

1．5．1 同源或比较建模

1．5．2 同源建模的使用以鉴别蛋白结构性质，功能和机制

1．5．3 同源建模：先导化合物鉴定中的方法和应用

1．6 研究内容及课题来源

1．6．1 研究目的意义及研究内容

1．6．2 课题来源

2 材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．1．1 培养基和各种试剂的配制

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 引物

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 EThrRS的异源表达与纯化

2．2．2 EThrRS突变体的异源表达与纯化

2．2．3 野生型EThrRS与突变体二级结构的比较

2．2．4 勃利霉素对ETbrRS和突变体酶活的体外抑制测定

2．2．5 勃利霉素分别对野生型EThrRS与突变体预稳态动力学的分析

2．2．6 勃利霉素或ATP与EThrRS的分子对接

2．2．7 PsThrRS三维结构的同源建模

2．2．8 勃利霉素与PsThrRS结合位点的研究

2．2．9 基于分子对接的PsThrRS抑制剂的虚拟筛选

2．2．10 PsThrRS抑制剂的药效团的分析

2．2．11 基于药效团模型的PsThrRS抑制剂的虚拟筛选

2．2．12 EThrRS与其它物种的ThrRS的多序列比对

2．2．13 分子动力学模拟

3 结果与分析

3．1 勃利霉素与EThrRS结合位点的研究

3．1．1 勃利霉素及ATP与EThrRS的分子对接

3．1．2 EThrRS与不同物种ThrRS的多序列比对

3．1．3 EThrRS的克隆与表达

3．1．4 EThrRS与突变体酶动力学参数的比较

3．2 勃利霉素与PsThrRS结合位点的研究

3．2．1 PsThrRS的同源模建

3．2．2 勃利霉素与PsThrRS结合位点的确定

3．3 PsThrRS抑制剂的虚拟筛选

3．3．1 勃利霉素结构类似物的搜索

3．3．2 PsThrRS筛选位置的确定

3．3．3 勃利霉素结构类似物与PsThrRS的虚拟筛选

3．3．4 PsThrRS抑制剂的药效团模型的建立

3．3．5 利用药效团模型Hypo 1对DrugBank全数据库的快速虚拟筛选

4 讨论

4．1 勃利霉素与EThrRS结合位点的研究

4．2 勃利霉素与PsThrRS结合位点的研究

4．3 PsThrRS抑制剂的虚拟筛选

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文