利用人体肠道菌发酵豆芽制备雌马酚的研究

摘要

雌马酚是大豆异黄酮重要的代谢终产物，由黄豆苷元在体内某些特定肠道菌的作用下特异性代谢得到，具有较异黄酮前体更高的生物活性，并且性质稳定，容易被人体吸收。临床数据表明，雌马酚具有预防乳腺癌、预防心血管疾病、骨质疏松，改善更年期综合征，保护神经以及抗衰老等方面有重要的功效。
　　 雌马酚的产出受到多种因素的影响，包括宿主基因，饮食习惯，药物作用等方面。本实验利用两名雌马酚产生者的菌群进行体外代谢，探讨了十种常见抗生素对于雌马酚代谢产生的影响，发现盐酸环丙沙星对雌马酚产出抑制作用最小，头孢曲松、盐酸多西环素以及土霉素基本完全抑制，其他抗生素对于两个这来源的菌群作用存在差异。
　　 本实验室课题组在前期工作中已成功地从女性体内筛选到两株可产生雌马酚的肠道菌，分别为屎肠球菌HY-1，以及Slackia属菌株HY-2，本实验以提高两株菌代谢产出雌马酚的能力为目的，对HY-1、HY-2的培养条件进行了优化，并且在BHI培养基的基础上对培养基成分进行调整，通过两株菌转化黄豆苷元的特性，利用豆芽发酵，进行雌马酚粗提取工艺的研究。
　　 首先对HY-1，HY-2纯培养与混合培养方式中雌马酚的产量进行比较，发现混合培养后雌马酚的产量有所提高，确定混合培养两株菌的接种比例，通过单因素实验对混合培养的生长条件进行筛选，并且利用正交实验优化，优化后得到的最佳生长条件为:HY-1，HY-2以1∶1的比例接种，接种量为4％，培养基初始PH值为7.0，发酵温度为38℃。未优化前，HY-1单独培养产量为0.25μg/mL、0.361μg/mL，优化后得到雌马酚浓度为0.6μg/mL，浓度分别提高了1.31倍、0.67倍。
　　 以BHI培养基作为基础培养基，通过单因子实验，对补充的碳源、氮源、无机盐及生长因子初步筛选，得到能够提高雌马酚产量的影响因素，采用Plackett-Burman设计对影响因素进行考察，确定乳糖、柠檬酸、硝酸钠对菌株产生雌马酚的影响显著。利用最陡爬坡实验确定出显著因素的最佳取值区域，采用Box-Benhnken中心组合实验设计及响应面分析确定最佳条件。结果表明，补充最佳培养基的组成为:BHI脑心浸液38g/L，乳糖2.59g/L，柠檬酸1.48 g/L，硝酸铵1.26 g/L．硫酸铵1.25 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸二氢钾0.4 g/L，L-半胱氨酸0.06 g/L，验证实验得到雌马酚浓度为1.47μg/mL，较未优化前提高了1.45倍。
　　 以实验得到的最佳培养基组成及最佳生长条件为基础，利用HY-1、HY-2对豆芽粉进行发酵，通过单因素实验考查乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对发酵豆芽中雌马酚提取效果的影响，利用正交实验确定最佳提取工艺条件为乙醇浓度为80％，料液比1∶20，提取温度为50℃，提取时间4h，验证实验得到雌马酚浸提量为137.02μg/g，粗提物中雌马酚的含量为2.12mg/g。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 大豆异黄酮转化雌马酚的途径

1．2 雌马酚的研究进展

1．2．1 植物雌激素和抗雌激素作用

1．2．2 抗氧化活性

1．3 雌马酚表型的个体差异和影响因素

1．3．1 雌马酚产生者的定义

1．3．2 影响雌马酚产生表型的因素

1．3．3 抗生素对雌马酚代谢的影响

1．4 制备雌马酚的方法

1．4．1 化学合成制备雌马酚

1．4．2 微生物发酵法制备雌马酚

1．5 肠道内产雌马酚菌的研究进展

1．5．1 动物体内的产雌马酚菌株

1．5．2 人体肠道内的产雌马酚菌株

1．5．3 混合培养产出雌马酚的菌株

1．6 课题研究目的及意义

1．7 本研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 试验菌株

2．1．2 试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 基础培养基

2．2 实验方法

2．2．1 抗生素对体外代谢产出雌马酚的影响

2．2．2 产雌马酚菌株发酵培养条件优化

2．2．3 产雌马酚菌株发酵培养基组成的优化

2．2．4 发酵豆芽粉中雌马酚粗提取工艺的研究

2．2．5 数据统计分析方法

3 结果与分析

3．1 抗生素对体外代谢产出雌马酚的影响

3．1．1 绘制雌马酚标准曲线

3．1．2 确定雌马酚产出者

3．1．3 抗生素对人体雌马酚含量的影响

3．2 产雌马酚菌株发酵培养条件的优化

3．2．1 单因素试验

3．2．2 正交试验

3．2．3 验证实验

3．3 产雌马酚菌株发酵培养基组成的优化

3．3．1 单因素实验

3．3．2 Plackett-Burman设计结果

3．3．3 最陡爬坡实验确定最佳区域

3．3．4 响应面法优化培养基组成

3．4 发酵豆芽粉中雌马酚粗提取工艺的研究

3．4．1 发酵豆芽粉中提取雌马酚的单因素试验

3．4．2 正交试验确定最佳乙醇提取工艺

3．4．3 验证试验

4 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文