雌核发育双单倍体牙鲆(Paralichthys olivaceus)的纯合性鉴定和性腺的组织学观察

摘要

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国沿海岸分布的重要经济鱼类，在日本、韩国沿海也有分布。牙鲆个体硕大、肉质鲜美、营养价值很高，同时具有一定的药用价值，因而拥有广阔的市场。但由于过度捕捞和环境污染，造成自然资源大幅度衰减，供需矛盾较大，促使牙鲆人工养殖得到迅速的发展。由于牙鲆雌、雄性的生长差异，牙鲆的全雌化养殖成为研究的热点。
　　 雌核发育，根据处理原理的不同，可分为减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育。鱼类的有丝分裂雌核发育能够产生纯合后代，即雌核发育双单倍体(Doubled Haploid，DH)。利用完全纯合的DH再次诱导雌核发育，可以获得克隆鱼。DH及其克隆系的纯合特性，决定了其在遗传和基因组研究以及鱼类育种方面，具有巨大的研究和应用价值。但由于DH的孵化率很低，成活率也不高，研究材料及其珍贵，故其性腺组织学研究还未见报道。本文利用微卫星标记方法对DH牙鲆进行了纯合性鉴定，并对其性腺进行了组织学观察，对其性比及性腺组织学特征进行了描述与分析，以期深入了解DH鱼类的生物学特征。
　　 通过紫外线照射真鲷(Pagrosomus major)精液，利用灭活的精子激活牙鲆的卵子，诱导牙鲆有丝分裂雌核发育。激活后的卵子静置3 min后加入17℃海水培育60 min，然后转移至静水压力机中，施加压力650 kg/cm2，持续6 min，完成雌核发育诱导后，移至常温海水中孵化，之后在水泥池内培育2年，获得试验样本129尾。
　　 根据Genebank上公布的以及EST-SSR方法寻找微卫星标记，根据微卫星标记设计引物，之后利用牙鲆亲本基因组DNA对微卫星标记进行多态性筛选，筛选出的20个标记用于试验群体的纯合性鉴定:结果发现，这一群体的20个位点都是纯合的，纯合度很高，标记的分型结果可以用于基因连锁图谱的构建。
　　 组织学切片结果显示，在129尾样本中，雌性88尾，占试验群体总数的68％;雄性37尾，占试验群体总数的29％;无法区分雌雄的4尾，占试验群体总数的3％，雌雄比例约为1∶0.42;对照组普通牙鲆的雌雄性比为55∶45，接近1∶1。
　　 DH的卵巢发育阶段基本一致，处于Ⅱ期。少数DH的卵巢发育正常，多数卵巢的卵母细胞结构发生变化，在胞核和胞质中都有体现，呈畸形发育，根据形态结构可分为7种类型。对照组卵巢发育至Ⅲ期，与对照组相比，DH的卵巢发育较迟缓。根据正常发育卵母细胞所占比例，定义正常卵母细胞比例在50％以上的卵巢为发育正常卵巢，少于50％的为发育异常卵巢。结果发现有82尾DH牙鲆的卵巢发育不正常，说明DH家系的雌性不育或者繁殖力低下。
　　 DH的精巢发育多停滞在Ⅱ期，精原细胞成簇分布于精小囊内，精小囊无腔隙，小叶间有结缔组织，精原细胞在小叶间成群排列，未有进一步的分化，说明雄性是不育的。少数精巢发育正常并具有精子，但与对照组精巢结构:精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞以及精子等相比，结构上有差异，精原细胞部分愈合，其它精细胞也较少。
　　 在DH的卵巢中观察到卵黄核的解聚过程，可能与脂肪的形成有关。
　　 在DH及对照中部分雄性个体的性腺中观察到少量的卵母细胞，为两性嵌合体，这与DH的基因纯合性无关，或许可能是牙鲆性腺发育中的一种性逆转现象。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 牙鲆的生物学

1．1．1 形态和习性

1．1．2 繁殖和生长

1．2 鱼类的双单倍体

1．2．1 雌核发育双单倍体

1．2．2 雄核发育双单倍体

1．3 双单倍体鱼类的制备

1．3．1 精子(或卵子)的遗传失活

1．3．2 雌核发育(或雄核发育)二倍体的诱导

1．3．3 雌核发育二倍体的倍性鉴定

1．4 双单倍体鱼类的应用

1．4．1 选择育种

1．4．2 遗传和QTL作图

1．4．3 快速建立纯系

1．4．4 性别决定机制的判断

1．5 双单倍体鱼类的特性

1．5．1 双单倍体鱼类的产量

1．5．2 双单倍体鱼类的成活率

1．5．3 双单倍体鱼类的性比

1．5．4 双单倍体鱼类的繁殖力

1．6 研究内容

1．7 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验鱼群体

2．1．2 微卫星标记

2．2 试验仪器

2．3 试验试剂及配制方法

2．3．1 试验试剂

2．3．2 配制方法

2．4 试验方法

2．4．1 样品的采集

2．4．2 基因组DNA的提取

2．4．3 PCR反应

2．4．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色

2．4．5 组织学切片及染色

2．4．6 分析方法

3 结果与分析

3．1 试验群体的纯合性

3．2 试验群体的特征及性比

3．3 对照组的卵巢发育

3．4 对照组的精巢发育

3．5 DH牙鲆的卵巢发育

3．5．1 发育滞后卵巢

3．5．2 发育异常卵巢

3．6 DH牙鲆的精巢发育

3．7 卵黄核的观察

3．8 两性嵌合体

4 讨论

4．1 DH牙鲆的纯合性

4．2 DH牙鲆的性比

4．3 牙鲆的性别决定

4．4 卵母细胞发育异常

4．5 精巢发育停滞

4．6 卵黄核

4．7 两性嵌合体

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文