双单倍体牙鲆纯合不育个体的蛋白质组和转录组学研究

摘要

牙鲆（Paralichthys olivaceus）个体大、生长速度快、肉质细嫩鲜美，被视为名贵的海产养殖鱼类，深受我国广大消费者的喜爱，市场销售前景广阔。牙鲆雌性生长速度快于雄性，养殖全雌牙鲆对提高其生长速度、缩短养殖周期和提高养殖经济效益具有重要意义。利用有丝分裂雌核发育技术不仅能够生产全雌鱼，还能够生产基因完全纯合的个体，即双单倍体(DH)，在此基础上再进行一代雌核发育可以生产基因型完全一致的纯合克隆系，这对雌核发育育种的理论研究和实际应用均具有重要意义。但存在的问题是DH鱼诱导困难，繁殖力低，极大的影响了DH和克隆鱼的进一步应用。目前关于DH鱼的繁殖问题开展的研究工作较少，仅有的少量研究主要集中在繁殖能力的表型描述上，具体的不育机制尚不清楚。因此，本研究通过减数分裂雌核发育提高牙鲆纯合度后，以此为亲本诱导DH，探讨提高DH诱导效率的可行性;同时以同龄性腺正常发育的牙鲆为对照，对DH牙鲆的促性腺激素和性类固醇激素含量进行了测定，以期从内分泌学角度揭示DH牙鲆性腺发育异常的原因;在此基础上对同一家系可育和不育牙鲆的性腺进行了蛋白质组学和转录组学的比较，筛选了可育和不育性腺的差异表达蛋白和基因，探讨引起DH纯合不育的分子机制，并为寻找其中起关键作用的蛋白和基因并研究其功能提供有用的信息。主要研究结果如下:
　　(1)利用普通牙鲆亲鱼6尾（记为C1、C2、C3、C4、C5、C6）和减数分裂雌核发育组牙鲆6尾（记为G1、G2、G3、G4、G5、G6）进行DH诱导实验，探讨亲鱼纯合度与DH诱导率的关系。结果表明，雌核发育组的纯合度极显著高于普通组（P＜0.01），雌核发育组平均纯合度为0.70，而普通组亲鱼的平均纯合度仅为0.43。有5尾普通亲鱼（G2-G6）诱导的后代在开口前全部死亡，对剩余7尾亲鱼的后代在生长至20日龄时各取30尾仔鱼进行后代纯合性检验，发现有2尾雌核发育亲鱼的后代中出现了杂合个体，而在普通亲鱼后代中并未出现，推测后代中是否出现杂合子与亲本的纯合度并无直接无关。从诱导率上来看，无论是折算孵化率还是折算正常率，雌核发育组均要显著高于普通牙鲆组。通过相关分析发现，亲本纯合度与折算孵化率的Pearson相关性密切，其相关系数为0.920，达到极显著水平(P＜0.01);亲本纯合度与折算正常率的Pearson相关性密切，其相关系数为0.925，达到极显著水平(P＜0.01)。另外，本实验诱导了C1和G3的减数分裂雌核发育，其诱导率和正常率均高于有丝分裂雌核发育。
　　(2)以2009年在北戴河中心实验站培育的DH牙鲆为材料，以同龄的两性受精牙鲆为对照，在1月、3月和5月进行尾部采血，采用酶联免疫方法测定和比较了血清雌二醇(E2)、睾酮(T)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)和17α，20β-双羟孕酮(17α，20β-DHP)的含量，同时在5月份取性腺进行切片观察发育情况，以期从内分泌学角度揭示DH牙鲆性腺发育异常的原因。结果表明，DH组牙鲆性腺体积小，性腺成熟系数低，仅为4.0％，卵母细胞多为不规则的多角形，以Ⅱ期和Ⅲ期为主，外部只有一层滤泡细胞。而对照组牙鲆性腺体积大，性腺成熟系数极显著高于DH牙鲆，达到了10.1％，细胞核膜消失并开始向动物极迁移，此时卵巢内以成熟的Ⅳ期和Ⅴ期卵母细胞为主。激素水平上来看，在1月和3月份时，各激素含量与对照组牙鲆均未出现显著性差异，而5月份各激素含量均出现了显著性变化，其中DH不育牙鲆的E2含量显著低于对照组，同时LH和FSH的含量也要显著低于对照组，T和17α，20β-DHP含量DH组却显著高于对照组，推测不育个体的T转化为E2和E2与17α，20β-DHP途径转换过程中出现了异常。
　　(3)以选取同一DH家系中3条能够正常产卵的DH牙鲆为对照，3条无法正常产卵的DH牙鲆为实验组进行了差异蛋白质学研究。通过双向凝胶电泳结合质谱技术对可育和不育的蛋白质组结果进行比较，共发现了42个差异显著的蛋白，其中不育组中高表达蛋白11个，可育组中高表达蛋白31个。31个可育组高表达蛋白当中有2个蛋白只在可育组中表达，不育组中未见表达。差异蛋白中Vtg在不育组中的含量要显著低于可育组，这与组织切片中观察到的不育组卵母细胞发育过程中卵黄积累不足相一致，暗示不育组性腺发育停止与Vtg的含量较低有关。性类固醇调控相关的2个蛋白，核基质结合因子2(SAFB2)和胆固醇侧链内切酶(P450SCC)也在不育组中低量表达，尤其是SAFB2在不育组中未见表达，会对不育DH牙鲆的性类固醇生成途径产生影响。此外，3个和钙离子平衡相关的蛋白在不育组中的表达同样低于可育组，分别为NUCB1、EFCAB3和EFCAB4B蛋白，推测这3个蛋白通过调控钙离子的平衡来影响牙鲆的性腺发育。
　　(4)采用RNA-Seq技术研究了同一家系可育DH牙鲆和不育DH牙鲆性腺组织的转录组，并对差异表达基因进行了统计分析。应用CAP3软件聚集全部转录样本的装配结果，获得的转录组测序结果包括了52474个contigs和N50长度是2895bp;应用BWA软件将cleanreads定位到All-Unigene，定位率可以达到99％，说明装配质量良好;获得的unigenes中有31831条能够比对到斑马鱼上，通过GO注释可以发现，有29416条unigenes注释到了生物学进程，29475条unigenes注释到了分子功能，29464条unigenes注释到了细胞组分。对可育组和不育组表达差异的unigene进行筛选，得到差异表达unigenes1225个，包括492个上调unigenes和733个下调unigenes。1225条unigenes当中有573个基因被注释，其中351个参与了生物学进程，63个处于细胞位置和128个具有分子功能(P＜0.01)。显著上调基因主要参与了甾醇代谢进程、类固醇生物合成进程和C21类固醇生物学合成等进程，在这些进程中主要是CYP11A1，CYP11B2，CYP17A1，CYP21A1，HSD3β和PRLR这6个基因高量表达。显著的下调基因主要参与了免疫反应、维生素D代谢进程、抗原加工、血红蛋白输入、肾吸收、转胞吞作用、脂肪蛋白转运和蛋白质水解作用等进程。通过KEGG数据对差异显著基因进行Pathway分析，利用fish exact rest检验发现62个pathways具有显著性，包括26个显著上调的pathways和36个显著下调的pathways。最显著的pathway是类固醇生物合成途径，主要被4个基因影响，分别是CYP11A1，CYP11B2，CYP17A1和CYP21A1。另外一个重要的途径是卵巢类固醇生成途径，其它重要的途径包括金黄色酿脓葡萄球菌感染、自身免疫甲状腺疾病、造血细胞系、蛋白消化和吸收等主要受下调基因影响。
　　综合上述，本研究得到以下结论:亲鱼的纯合度越高，DH的孵化率越高，孵化出的个体畸形率越低，利用减数分裂雌核发育提高后代的纯合度，再进行诱导DH，可以提高DH牙鲆的诱导效率。通过对可育牙鲆和不育牙鲆的蛋白质组、转录组学分析可以看出，一些调控性固醇激素合成进程中的重要基因和蛋白，如CYP11A1、CYP11B2、CYP17A1、CYP21A1、SAFB2等均在不育牙鲆中低量表达，而且通过激素水平测定也发现，LH、FSH和E2在繁殖季节均要显著低于可育组，这可能是引起DH牙鲆卵母细胞发育滞后，性腺不能正常发育的主要原因。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 双单倍体鱼类的研究进展

1．1．1 双单倍体鱼类韵诱导方法

1．1．2 双单倍体鱼类的生物学特性

1．1．3 双单倍体和克隆鱼类的应用研究进展

1．2 鱼类卵子发生机制的研究进展

1．2．1 PGCs的特征、起源和迁移

1．2．2 卵原细胞期

1．2．3 卵母细胞生长

1．2．4 卵母细胞的成熟和水合

1．2．5 排卵

1．2．6 卵泡闭锁

1．2．7 成熟的卵

1．3 研究背景和意义

2 材料与方法

2．1 牙鲆诱导双单倍体成功率的比较研究

2．1．1 试验材料

2．1．2 基因组DNA的提取

2．1．3 微卫星引物

2．1．4 PCR反应及电泳检测

2．1．5 数据分析

2．2 双单倍体牙鲆纯合不育个体的激素水平变化研究

2．2．1 试验材料

2．2．2 血液采集

2．2．3 组织切片

2．2．4 激素水平测定

2．2．5 数据统计与分析

2．3 双单倍体牙鲆纯合不育个体的蛋白质组学研究

2．3．1 试验材料

2．3．2 试剂配置

2．3．3 蛋白样品制备

2．3．4 蛋白样品定量

2．3．5 双向凝胶电泳

2．3．6 染色

2．3．7 扫描

2．3．8 酶解

2．3．9 质谱上样

2．3．10 数据检索

2．4 双单倍体牙鲆纯合不育个体的转录组学研究

2．4．1 试验材料

2．4．2 RNA提取

2．4．3 cDNA文库的构建

2．4．4 RNA测序、组装和数据处理

2．4．5 CDS预测、SSR和SNP分析

2．4．6 荧光定量PCR

3 结果与分析

3．1 牙鲆诱导双单倍体成功率的比较研究

3．1．1 亲本纯合度检验

3．1．2 DH的纯合个体比例

3．1．3 不同亲鱼的诱导率

3．1．4 相关性分析

3．2 双单倍体牙鲆纯合不育的激素水平变化研究

3．2．1 可育和不育牙鲆的卵巢组织学观察

3．2．2 不育牙鲆和对照组牙鲆血清激素含量的比较

3．3 双单倍体牙鲆纯合不育个体的蛋白质组学研究

3．3．1 牙鲆纯合不育个体和可育个体的蛋白质组学图谱比较

3．3．2 差异表达蛋白点的质谱鉴定

3．3．3 一些重点关注差异蛋白的胶图及表达量对比

3．4 双单倍体牙鲆纯合不育个体的转录组学研究

3．4．1 Illumina测序和装配结果

3．4．2 CDS预测和unigenes注释

3．4．3 SSR和SNP分析

3．4．4 差异表达基因功能分析

3．4．5 共表达网络

3．4．6 荧光定量PCR对测序结果的验证

4 讨论

4．1 牙鲆诱导DH成功率的比较研究

4．1．1 不同纯合度亲鱼诱导牙鲆DH效率的比较

4．1．2 诱导DH时杂合子产生的原因

4．2 DH牙鲆纯合不育的激素水平变化研究

4．2．1 DH牙鲆性腺发育的组织学特征

4．2．2 DH牙鲆的性腺发育过程中的激素水平变化特征

4．3 DH牙鲆纯合不育的蛋白质组学研究

4．4 DH牙鲆纯合不育的转录组组学研究

4．4．1 不育牙鲆性腺低表达基因分析

4．4．2 不育牙鲆性腺高表达基因分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文