乳酸乳球菌KLDS4.0325全基因组序列的测定及比较分析

摘要

乳酸乳球菌被广泛的应用于酸奶和干酪等食品的发酵。一些乳酸菌的功能特性已得到证实。乳酸乳球菌基于基因型和表现性可分为乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种。乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0325是东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室在2003年从中国新疆地区传统家庭自制酸马奶样品中分离出的一株乳酸菌。经常规实验发现，该菌株与其它菌株相比具有显著的高产双乙酰的性能。传统意义上乳酸菌优良菌株的选育和机理性研究主要依赖于相关理化试验对菌株性能的测定以及依赖于动物模型（如小白鼠、兔子等）对菌株益生性能的评价。这种方式虽然可以准确的获得与菌株有关的一些代谢和益生方面的信息，但同样存在一些问题。比如，不断地需要大量的人力和物力周而复始的对某一菌株进行性能测定，但同时又无法从基因水平上认识到菌株某一显著特性的遗传机理，因而无法进一步为菌株后续的基因改造及遗传育种提供理论依据。伴随着人类基因组计划的进行，大量物种的全基因组序列得以测定。此外，各种生物信息学数据库(GenBank, EMBL，DBCAT, DDBJ，PIR，MIPS，COG等)以及序列分析软件(SOAP denovo，Glimmer, Prophinder, CRISPRFinder, IslandViewer, GeneMark，tRNAscan-SE等)不断的被丰富和开发出来。同时，关于乳酸菌的基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及功能基因组学等研究思路和方法的不断出现，这些都为人们进一步深入全面的了解和认识乳酸菌揭开了新的篇章。 为了揭示乳酸乳球菌KLDS4.0325的遗传组成与生理功能之间的关系，阐明其生理及代谢机制，并对其重要功能基因进行挖掘。我们对菌株KLDS4.0325的全基因组序列进行测定、绘制了基因组图谱，并利用生物软件和数据库完成对序列的注释及相关工业发酵性能潜力的预测分析。最终对乳酸乳球菌KLDS4.0325在基因水平上表现出的优异性状进行实验验证。 利用生物信息学软件对菌株KLDS4.0325基因组与公共数据库中的乳酸乳球菌IL1403，乳酸乳球菌CV56，乳酸乳球菌KF147以及乳酸乳球菌NZ90004株乳球菌基因组进行了比较分析。另外，比较基因组学的方法被用于菌株KLDS4.0325在工业发酵潜能及其它方面的预测分析，包括蛋白质水解系统、氨基酸代谢途径、碳水化合物的转运、代谢以及乳酸合成途径、B族维生素的合成途径、以及细菌素合成基因簇、冷应激蛋白基因等方面，并与公共数据库中已知的全部9株乳球菌进行比较。 结果表明:菌株KLDS4.0325的基因组全长2，589，250bp，G+C含量为35.4％，共预测出2662个开放阅读框，其中1310个具有潜在的生物学功能。另外，还预测出了62个tRNA基因和6个rRNA基因。菌株菌株KLDS4.0325的基因组中有2，438个开放阅读框架与4株参考菌株是一致的，2，215个有80％的序列一致性。菌株KLDS4.0325的基因组中具有一系列可以有效对细胞外蛋白质进行水解、降低苦味肽以及产生一系列能够抑制血管紧张素转化酶活性的活性肽编码基因。在转氨途径方面，菌株KLDS4.0325具有较为完整的酶系统，可催化相关氨基酸转化为风味物质。菌株KLDS4.0325的基因组中存在较多能够编码细胞外糖转运、代谢以及L-乳酸合成的基因。在B族维生素合成方面，菌株KLDS4.0325的基因组中含有叶酸和核黄素合成途径的一系列完整的基因。此外，在菌株KLDS4.0325的基因组中预测出了1个乳球菌素基因簇和2个冷应激蛋白CspD和CspE的编码基因。 糖代谢实验表明菌株KLDS4.0325可以对甘露醇、果糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖盐、麦芽糖和半乳糖进行利用而不能对半乳糖醇进行利用，以及可以更加快速的利用乳糖和蔗糖。这一结果与之前菌株的糖代谢能力预测结论相一致。 蛋白水解度实验表明菌株KLDS4.0325的蛋白水解速率和水解度均与商业菌株有一定的差距，尽管如此，菌株KLDS4.0325最终的蛋白质水解度仍达到了0.8072左右。 菌株KLDS4.0325全基因组序列的测定为挖掘该菌株的工业性能以及益生特性提供了新的研究方向，编码菌株显著特性基因的存在为菌株KLDS4.0325能够进行工业发酵提供了理论基础。本研究的进行对于新工业菌株的开发以及菌株的改良和育种都具有重要的推动作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 乳酸菌概述

1．2．2 微生物基因组学

1．2．3 乳酸菌工业发酵的重要代谢产物合成途径

1．3 研究的目的和意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

1．4 研究内容

1．5 课题来源

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的活化及总DNA的提取

2．2．2 基因组的测序、组装及注释

2．2．3 生物信息学分析

2．2．4 菌株发酵特性测定

3 结果与分析

3．1 菌株KLDS4．0325的DNA提取

3．2 菌株KLDS4．0325的16S rRNA序列相似性分析

3．3 菌株KLDS4．0325的染色体基因组一般特征

3．4 乳酸乳球菌KLDS4．0325的蛋白质水解系统的比较分析

3．4．1 乳酸乳球菌KLDS4．0325的细胞壁粘附蛋白

3．4．2 乳酸乳球菌KLDS4．0325的肽转运系统

3．4．3 乳酸乳球菌KLDS4．0325的肽酶

3．5 乳酸乳球菌KLDS4．0325氨基酸风味形成途径的比较分析

3．5．1 乳酸乳球菌KLDS4．0325转氨途径涉及的酶

3．5．2 乳酸乳球菌KLDS4．0325的蛋氨酸／半胱氨酸代谢途径涉及的酶

3．6 乳酸乳球菌KLDS4．0325的糖代谢过程及乳酸生物合成途径的比较分析

3．6．1 乳酸乳球菌KLDS4．0325的糖转运系统

3．6．2 乳酸乳球菌KLDS4．0325将转运至细胞内的相关糖类物质转化为糖酵解途径中间产物的过程

3．6．3 乳酸乳球菌KLDS4．0325利用产生的糖酵解中间产物进行乳酸合成的途径

3．7 乳酸乳球菌KLDS4．0325的B族维生素生物合成途径的比较分析

3．7．1 乳酸乳球菌KLDS4．0325的叶酸生物合成途径

3．7．2 乳酸乳球菌KLDS4．0325的核黄素生物合成途径

3．7．3 乳酸乳球菌KLDS4．0325的其它B族维生素合成途径

3．8 乳酸乳球菌KLDS4．0325的细菌素合成基因簇分析

3．9 乳酸乳球菌KLDS4．0325的冷应激蛋白基因分析

3．9．1 冷应激蛋白CspD

3．9．2 冷应激蛋白CspE

3．10 功能特性的验证试验

3．10．1 菌株KLDS4．0325的生长曲线

3．10．2 菌株KLDS4．0325的蛋白质水解性能的测定结果

3．10．3 菌株KLDS4．0325的产酸能力测定结果

3．10．4 菌株KLDS4．0325的糖发酵实验结果

4 讨论

4．1 菌株KLDS4．0325的蛋白质水解系统

4．2 菌株KLDS4．0325的氨基酸降解成风味物质系统

4．3 菌株KLDS4．0325的糖代谢系统

4．4 菌株KLDS4．0325的B族维生素合成系统

4．5 菌株KLDS4．0325其它基因的预测

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文