鸡β--防御素抗传染性支气管炎病毒机制的初步研究

摘要

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)感染鸡，引起的一种急性、高度接触性传染病，主要造成雏鸡大量死亡，蛋鸡产蛋量和蛋品质下降，肉鸡饲料转化率降低等严重危害。此外，IBV易发生基因突变和重组，导致抗原漂移和抗原转换。不同IBV血清型之间交叉保护性较低，以致选用的疫苗若与地方流行毒株血清型不同而导致免疫失败，且IBV易引起其他病原微生物的混合感染。因此，本研究以天然免疫防御中重要的多功能小分子多肽（禽β-防御素）为研究对象，探讨天然免疫对病毒的防御作用，期望从提高天然免疫的角度，找到抗IBV感染的新途径。 禽β-防御素(Avian beta defensins，AvBDs)为富含阳离子的小分子多肽，是禽类先天性免疫系统的重要组成部分，是抵御病原微生物入侵的重要屏障。本试验采用滴鼻点眼法，选用IBV强毒CK/CH/LHLJ/04V P3、IBV弱毒CK/CH/LHLJ/04V P110分别接种15日龄雏鸡5只，作为攻毒组;另留5只未处理的雏鸡作为对照组。攻毒3日后，采集攻毒组和对照组15种组织器官。用荧光定量PCR法分别检测采集样品中，AvBD1-13、10种鸡Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达量。结果表明经IBV诱导后，鸡AvBD2、6、12基因在多数被检组织中的表达量变化差异显著，因此选用大肠杆菌对其进行原核诱导表达，并进一步检测了这3种重组蛋白的抗IBV等生物学活性及安全性。 试验结果表明: (1)荧光定量PCR检测结果表明，AvBD1、2、4、5、6、9经IBV弱毒诱导后在被检测组织中表达量普遍下调，而经IBV强毒诱导后在大部分被检测的组织中的表达量显著上调;AvBD10经IBV强弱毒诱导后的变化与上述变化相反;经IBV强弱毒分别诱导后，在被检测的大部分组织中的AvBD3、11、12、13表达量普遍上调(P＜0.05)。经IBV强毒株诱导后，所检测的TLRs和iNOS的表达量普遍上调;IBV弱毒诱导后，TLRs和iNOS的表达量在大部分被检测的组织中普遍下调。 (2)经IBV强、弱毒株诱导后，鸡AvBD2、6、12基因在多数被检组织中的表达量变化显著，因此选择鸡AvBD2、6、12进行原核诱导表达，获得的三种重组蛋白分子量为10-15ku，均以包涵体形式存在。体外抗病毒试验结果表明，三种重组蛋白对IBV具有显著的杀灭作用，AvBD6、12对病毒在鸡胚尿囊液中的增殖具有抑制作用。 (3)采用菌落计数法检测的结果显示，与阴性对照相比，三种重组蛋白对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、四链球菌和枯草芽孢杆菌均有显著的抑制作用（P＜0.05）;仅重组鸡AvBD12蛋白对金黄色葡萄球菌有抑制作用(P＜0.05)。三种重组蛋白具有盐离子浓度依赖性，随着氯化钠浓度的升高，对大肠杆菌和四联球菌的抗菌活性显著下降(P＜0.05)。重组鸡AvBD12蛋白对猪霍乱沙门氏菌、兔波士杆菌和嗜酸乳杆菌有不同程度抑制作用;在高盐浓度下，该蛋白对金黄色葡萄球菌和兔波士杆菌仍具有抑菌活性。 (4)三种重组蛋白溶血活性极低，与阴性对照相比无显著差异(P＞0.05)。 综上所述，鸡AvBD2、6、12具有广谱抗细菌和IBV的作用，且对鸡血红细胞无明显毒性。由防御素介导的天然免疫存在于鸡的多种组织器官中，IBV可能刺激并调节鸡体内AvBDsmRNA的表达。这些结果表明病毒粒子直接介导鸡AvBDs的部分抗病毒作用。这些肽类对病原(IBV)识别和启动对病原微生物免疫反应可能具有一定作用。目前研究仅检测鸡β-防御素的mRNA，而这些肽类将通过ELISA方法在今后的研究中进一步检测。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 抗菌肽简介

1．1．1 抗菌肽的定义及分类

1．1．2 抗菌肽的作用机制

1．2 防御素的研究进展

1．2．1 防御素的结构特征及分类

1．2．2 防御素的生物活性

1．3 禽防御素的研究进展

1．3．1 禽防御素的诱导表达

1．3．2 禽TLRs及其信号转导机制

1．4 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 菌种、质粒及病毒

2．1．3 主要试剂及配制

2．1．4 主要仪器

2．1．5 主要应用软件

2．2 鸡AvBDs、TLRs、iNOS经IBV诱导后的组织表达差异

2．2．1 实验设计及方法

2．2．2 样品处理及RNA提取

2．2．3 荧光定量PCR引物设计

2．2．4 荧光定量标准品制备

2．2．5 鸡AvBDs、TLRs、iNOS组织表达量的检测

2．3 重组鸡AvBD2、6、12蛋白的诱导表达

2．3．1 表达载体构建

2．3．2 重组蛋白诱导表达及鉴定

2．3．3 蛋白的纯化及复性

2．4 重组鸡AvBD2、6、12融合蛋白抗IBV作用

2．4．1 试验设计及方法

2．4．2 IBV核酸提取

2．4．3 质粒标准品制备

2．4．4 病毒载量检测

2．5 重组鸡AvBD2、6、12融合蛋白抗菌活性测定

2．6 盐离子浓度对抗菌活性的影响

2．7 重组蛋白的溶血指数

2．8 统计分析

3 结果与分析

3．1 鸡AvBDs经IBV诱导后组织表达差异

3．2 鸡TLR、iNOS经IBV诱导后组织表达差异

3．3 原核表达载体构建

3．3．1 重组表达质粒pMD18-S-Chicken AvBD2、6、12的鉴定

3．3．2 重组表达质粒pProEX HTA-AvBD2、6、12的鉴定

3．4 重组鸡AvBD2、6、12蛋白的诱导表达与纯化复性

3．5 重组鸡AvBD2、6、12蛋白体外抗IBV活性检测

3．6 重组鸡AvBD2、6、12融合蛋白的抗菌活性

3．7 盐离子浓度对抗菌活性的影响

3．8 重组鸡AvBD2、6、12融合蛋白对鸡血红胞的溶血活性

4 讨论

4．1 IBV诱导鸡AvBDs、TLRs和iNOS组织表达差异

4．2 鸡TLRs的信号转导作用

4．3 重组鸡AvBD2、6、12蛋白的原核表达

4．4 重组鸡AvBD2、6、12蛋白的生物学特性

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文