粳稻杂种后代胚乳可溶性淀粉合成酶及同工型基因转录表达特性分析

摘要

直链淀粉含量（Amylose content，AC）是决定和改良稻米蒸煮食味品质的关键内在因素，对直链淀粉含量的合成及调控机理的研究是改良稻米品质的重要依据。淀粉的合成与积累是一系列酶促反应的结果，参与淀粉合成的酶主要有可溶性淀粉合成酶(soluble starchsynthase，SSS)，焦磷酸化酶和淀粉分支酶。其中SSS负责催化转移ADP-葡萄糖上的葡萄糖单元，通过形成新a-1，4糖苷键连接到淀粉分子支链非还原端，从而延伸葡聚糖链。虽然过去对表观数量性状遗传规律做了大量的研究，但数量性状遗传变异的分子机理方面研究甚少。 在本研究选取通过定向选择获得的籽粒直链淀粉含量具有超亲变异的杂交后代及其亲本作为试验材料，对灌浆过程的淀粉积累特性及可溶性淀粉合成酶在灌浆过程中的活性变化，基因家族mRNA表达特征等进行研究，分析可溶性淀粉合成酶基因遗传变异及表达规律。这些研究结果对明晰水稻杂种后代直链淀粉含量所产生超亲变异及其淀粉品质形成的机理，为进一步探索杂种后代数量性状的超亲遗传机制及更好的创新模式开发提供重要的理论基础和育种实践指导意义。 研究结果表明，胚乳淀粉积累方面，在灌浆过程中，两个组合的亲本及杂交后代的胚乳总淀粉、支链淀粉和直链淀粉积累趋势基本相同，AC高的品种总淀粉含量也高;AC低的后代及亲本积累的AC量始终低于AC高的后代及亲本，胚乳AC合成和积累速度的快慢主要受遗传因素的影响，比较在灌浆过程中合成和积累的AC量来看，AC高的基因型总是高于其低的基因型，而胚乳支链淀粉主要在灌浆前中期合成和积累，可能是直链淀粉合成的前体。 分析灌浆过程中胚乳SSS活性及与淀粉含量的关系表明，SSS活性表现为单峰曲线，在抽穗后17d左右达到峰值。灌浆前期酶活性与AC呈显著正相关，灌浆中后期与AC呈负相关。籽粒直链淀粉含量含量与酶活性显示正相关，但相关均未达到显著水平;可溶性淀粉合成酶活性与籽粒总淀粉含量的关系表现为，灌浆前期两者间呈显著正相关，而灌浆中后期呈不显著地负相关。 可溶性淀粉合成酶基因mRNA转录表达量变化特点分析显示，在灌浆过程中亲本及后代的胚乳OsSSSⅠ、OsSSSⅡ-1、OsSSSⅡ-3、OsSSSⅢ-1和 OsSSSⅢ-2基因是随籽粒灌浆进程其mRNA转录表达量为单峰曲线，峰值在抽穗后15d左右出现，OsSSSⅣ-2转录表达量呈逐渐下降趋势;而OsSSSⅠ，OsSSSⅡ-3和OsSSSⅢ-2基因mRNA转录表达量在灌浆各时期都比其它基因大;同时是水稻SSS基因家族中表达相对活跃的基因，与淀粉合成密切相关。灌浆15d时，直链淀粉含量高的基因型其SSSⅢ的 mRNA转录表达量也高，低的基因型其表达量也低。 相关分析表明，胚乳直链淀粉含量和可溶性淀粉合成酶活性与6种胚乳可溶性淀粉合成酶基因mRNA转录表达量关系相同，均表现为与OsSSSⅠ、OsSSSⅡ-3，OsSSSⅢ-2的mRNA转录水平显著正相关，与OsSSSⅡ-1、OsSSSⅢ-1，OsSSSⅣ-2mRNA转录表达量呈不显著正相关;支链淀粉含量与OsSSSⅠ、OsSSSⅡ-3、OsSSSⅢ-1的mRNA转录表达量呈不显著或显著的正相关，与OsSSSⅡ-1、OsSSSⅣ-2的mRNA转录表达量呈不显著和显著的负相关。 籽粒灌浆过程中参与淀粉合成的关键酶SSS、GBSS、SBE、DBE等各类同工型基因表达量大小和表达时间上的差异以及相互间的作用是无主效基因差异的亲本杂交产生的后代籽粒AC产生遗传变异或超亲变异的分子基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究目的与意义

1．2 国内外的研究进展

1．2．1 稻米胚乳淀粉的相关研究

1．2．2 稻米直链淀粉研究现状

1．2．3 稻米支链淀粉研究概况

1．2．4 可溶性淀粉合成酶研究进展

1．3 淀粉合成酶基因家族研究

1．4 半定量RT-PCR技术应用

1．5 研究内容

1．5．1 亲本及杂种后代胚乳淀粉积累特性比较

1．5．2 亲本及杂种后代胚乳SSS活性比较

1．5．3 RNA检测与SSS基因RT-PCR反应条件优化

1．5．4 亲本及杂种后代胚乳SSS基因mRNA转录表达量变化动态

1．5．5 胚乳SSS基因相对表达量与SSS活性及淀粉含量关系

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 试验方法

2．3 淀粉含量测定方法

2．3．1 籽粒直链淀粉含量测定方法

2．3．2 籽粒总淀粉含量测定方法

2．4 籽粒可溶性淀粉合成酶活性测定方法

2．5 可溶性淀粉合成酶基因mRNA表达量测定

2．5．1 试剂

2．5．2 序列获取

2．5．3 引物设计

2．5．4 胚乳基因组RNA提取

2．5．5 cDNA第一链合成

2．5．6 检测cDNA浓度

2．5．7 筛选各引物最佳退火温度

2．5．8 RT-PCR反应程序

3 结果与分析

3．1 亲本及杂种后代胚乳淀粉积累特性比较

3．2 亲本及杂种后代胚乳可溶-性淀粉合成酶活性比较

3．3 灌浆不同时期籽粒淀粉含量与可溶性淀粉合成酶活性相关性

3．4 RNA检测与SSS基因RT-PCR反应条件优化

3．4．1 RNA完整性及定量检测

3．4．2 SSS基因RT-PCR引物验证

3．4．3 可溶性淀粉合成酶基因最佳退火温度筛选

3．5 亲本及杂种后代胚乳SSS基因mRNA转录表达量变化动态

3．5．1 灌浆不同时期胚乳SSS基因mRNA表达量检测

3．5．2 灌浆过程中胚乳SSS同工型基因mRNA转录表达量变化动态

3．5．3 灌浆不同时期亲本及后代胚乳SSS基因mRNA相对表达量比较

3．6 胚乳SSS基因相对表达量与SSS活性及淀粉含量关系

4 讨论

4．1 关于籽粒淀粉积累特性

4．2 关于籽粒SSS活性与淀粉含量关系

4．3 关于籽粒可溶性淀粉合成酶同工型基因表达量及与直链淀粉关系

4．4 关于杂种后代籽粒直链淀粉数量遗传变异分子机理

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文