粳稻杂种后代氮代谢关键酶活性及相关基因转录表达和序列分析

摘要

蛋白质含量的高低对水稻蒸煮食味以及营养品质具有非常大的影响，是影响水稻品质的重要内在因素之一。现已明确，谷氨酰胺合成酶、铵转运蛋白酶、蛋白水解酶作为氮代谢关键酶对灌浆过程中籽粒蛋白质合成和积累起重要作用，与籽粒蛋白质含量高低有密切关系。另一方面，品种间有性杂交仍然是目前乃至将来培育水稻新品种的主要途径。因此，研究灌浆成熟过程中水稻杂种后代氮代谢关键酶活性变化及相关基因的表达特性和基因序列变异分析，对阐明水稻杂种后代籽粒蛋白质含量遗传变异的分子机理以及水稻优质育种具有重要的理论及实践指导意义。 在杂交组合Ⅰ东农423×藤系180以及组合Ⅱ系选1号×通769中，逐代按高、低两个方向进行选择蛋白质含量有显著差异的后代，通过盆栽试验系统地比较分析了稻米蒸煮食味品质性状、灌浆过程中籽粒谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶活性变化、氮代谢关键酶基因家族的mRNA表达特征及谷氨酰胺合成酶基因序列变异特点、氮素营养对上述性状和基因mRNA表达量的影响，旨在为阐明水稻杂种后代籽粒蛋白质含量超亲遗传变异的分子机理以及水稻优质育种提供理论依据。研究结果表明: 无论亲本间籽粒蛋白质含量有没有显著差异，其品种间杂种后代通过籽粒蛋白质含量的连续定向选择可以获得超亲变异的后代;在两个组合中，籽粒蛋白质含量高的后代直链淀粉含量都比蛋白质含量低的后代低，但食味值及RVA谱特性中的最高粘度、最低粘度和下降粘度值却都大，而粘滞峰消减值和最终粘度都小，表明籽粒直链淀粉含量对蒸煮食味品质性状的影响要大于蛋白质含量，因此降低籽粒直链淀粉含量更有利于提高稻米的蒸煮食味品质。 灌浆同时期组合Ⅰ和组合Ⅱ籽粒蛋白质含量低的后代及亲本积累的蛋白质量始终低于蛋白质含量高的后代及亲本，籽粒蛋白质积累量的高低主要受基因型的控制;在齐穗期增施氮肥可以显著提高灌浆不同时期的籽粒蛋白质含量及稻米的蛋白质含量。 在水稻灌浆过程中，组合Ⅰ和组合Ⅱ的亲本和杂种后代功能叶片和籽粒GS活性变化趋势基本一致，功能叶片GS酶活性逐步降低;籽粒GS酶活性逐渐增加，达到峰值后逐渐下降，呈单峰曲线变化;两个组合酶活性大小表现为，灌浆不同时期籽粒蛋白质含量高的亲本和后代功能叶片谷氨酰胺合成酶活性均比籽粒蛋白质含量的低亲本和后代酶活性高;籽粒蛋白质的合成与积累主要在灌浆前期，而且籽粒灌浆前期高蛋白质含量后代的谷氨酰胺合成酶活性明显大于低蛋白质含量后代;蛋白水解酶在水稻灌浆后期活性强，灌浆过程中高蛋白含量后代蛋白水解酶活性始终高于低蛋白含量后代;在齐穗期增施氮肥可以显著提高灌浆不同时期叶片和籽粒谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶活性。 灌浆过程中两个组合的亲本及杂种后代叶片谷氨酰胺合成酶和蛋白水解酶基因mRNA转录表达量变化趋势基本一致，随灌浆进程GS1.3基因的mRNA转录表达量逐渐增加，到抽穗后15-20d时表达量最高，随后表达量逐渐下降，呈单峰曲线变化;GS2基因的mRNA转录表达量在抽穗后10d达到峰值后逐渐降低的线性变化趋势;OsASP基因的mRNA转录表达量峰值出现在灌浆后期，随着灌浆进程呈逐渐增加的变化趋势;AMT5基因的mRNA转录表达量呈抽穗后10d达到峰值后逐渐降低的线性变化趋势;齐穗期增施氮肥均显著提高上述氮代谢关键酶基因的mRNA转录表达量。 灌浆过程中亲本及杂种亲本和后代籽粒谷氨酰胺合成酶基因GS1.3和GS2的mRNA表达量变化趋势在组合Ⅰ和组合Ⅱ中基本一致，呈现出GS1.3和GS2的mRNA表达量逐渐增加，峰值多数出现在抽穗后15d和20d，达到峰值后逐渐降低的单峰曲线变化;灌浆过程中在组合Ⅰ中，亲本OsASP基因mRNA相对转录表达量高于后代，而亲本AMT5基因mRNA相对转录表达量低于后代;在组合Ⅱ中，蛋白质含量高的后代氮代谢关键酶基因mRNA相对转录表达量始终是最高，蛋白质含量低的后代GS1.3基因mRNA相对转录表达量低于蛋白质含量低的亲本，其他氮代谢关键酶基因mRNA相对转录表达量均高于亲本。组合Ⅱ齐穗期增施氮肥均显著提高上述氮代谢关键酶基因的mRNA转录表达量，趋势基本一致，持续时间较未处理组合Ⅱ时间长。 本试验克隆的GS1.3和GS2基因全序列长分别为1113bp和1287bp，分别编码371和429个氨基酸;与GenBank中已发表的日本晴水稻品种核苷酸序列比较，亲本及后代同源性GS1.3基因分别为99.7％、99.8％、99.6％、99.6％，GS2基因分别为99.9％、99.9％、100％、100％;蛋白质含量不同的水稻品种间谷氨酰胺合成酶基因虽然保守性非常高，但品种间仍然存在个别碱基的差异;品种间杂交后代在基因交换和分离稳定过程中依然能发生碱基的变化和三联体密码的改变，以致氨基酸序列及酶蛋白的理化性质和功能域的变化。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 水稻蛋白质研究动态和趋势

1．1．1 水稻蛋白质含量与食味品质研究

1．1．2 水稻蛋白质形成积累动态的研究

1．2 水稻谷氨酰胺合成酶及基因表达调控研究概况

1．2．1 谷氨酰胺合成酶概况

1．2．2 谷氨酰胺合成酶作用机制

1．2．3 谷氨酰胺合成酶基因概况

1．2．4 谷氨酰胺合成酶基因表达调控

1．3 水稻铵转运蛋白酶及基因表达调控研究概况

1．3．1 铵转运蛋白酶及基因研究概况

1．3．2 铵吸收和转运蛋白基因表达调控

1．4 水稻蛋白水解酶及基因研究概况

1．5 氮肥对水稻氮代谢关键酶活性及籽粒蛋白质含量影响

1．6 本试验研究内容

1．7 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 试验方法

2．3 品质性状测定方法

2．4 水稻谷氨酰胺合成酶活性测定方法

2．5 水稻蛋白水解酶活性测定

2．6 数据统计分析方法

2．7 谷氨酰胺合成酶、铵转运蛋白酶、蛋白水解酶基因mRNA表达分析

2．7．1 功能叶片和籽粒胚乳基因组RNA提取

2．7．2 RT-PCR实验程序

2．8 谷氨酰胺合成酶cDNA克隆及全序列分析

2．8．1 总RNA提取

2．8．2 质粒与细菌菌株

2．8．3 PCR扩增水稻谷氨酰胺合成酶基因全长cDNA

2．8．4 PCR产物的克隆鉴定

2．8．5 cDNA序列分析

3 结果与分析

3．1 亲本及杂种后代蒸煮食味品质特性比较

3．2 灌浆不同时期亲本及杂种后代籽粒蛋白质积累特性比较

3．3 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片和籽粒氮代谢关键酶活性比较

3．3．1 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片蛋白水解酶活性比较

3．3．2 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片谷氨酰胺合成酶活性比较

3．3．3 灌浆不同时期亲本及杂种后代籽粒谷氨酰胺合成酶活性比较

3．4 灌浆期氮代谢关键酶活性与籽粒蛋白质含量间的相关系数

3．5 灌浆不同时期亲本及杂种后代氮代谢关键酶基因转录表达比较

3．5．1 RNA完整性、定量检测及纯化

3．5．2 灌浆不同时期亲本及杂种后代功能叶片和籽粒氮代谢关键酶基因mRNA表达量变化动态

3．6 氮肥对叶片和籽粒氮代谢关键酶基因mRNA表达量的影响

3．7 灌浆不同时期亲本及杂种后代叶片和籽粒氮代谢关键酶基因相对转录表达量比较

3．7．1 灌浆不同时期亲本及杂种后代叶片氮代谢关键酶基因相对转录表达量比较

3．7．2 灌浆不同时期亲本及杂种后代籽粒氮代谢关键酶基因相对转录表达量比较

3．8 胚乳GS cDNA的克隆及全序列分析

3．8．1 胚乳cDNA库的合成

3．8．2 胚乳GS1．3和GS2基因全长cDNA序列的获得

3．8．3 胚乳GS1．3和GS2基因全长cDNA序列分析

3．8．4 胚乳谷氨酰胺合成酶功能域比较分析

3．8．5 胚乳GS1．3和GS2基因编码蛋白质性质和结构特点比较分析

4 讨论

4．1 关于蛋白质含量选择和食味品质的关系

4．2 关于氮代谢关键酶活性与蛋白质含量关系

4．3 关于氮代谢关键酶基因mRNA表达与蛋白质含量关系

4．4 关于杂种后代GS基因结构变异与蛋白质含量关系

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文