胰岛素受体底物1和2敲低对猪肝脏细胞糖脂代谢的影响

摘要

根据最新的流行病学研究，糖尿病正在成为全世界范围内的流行疾病。2型糖尿病(type2diabetes mellitus，T2DM)是一种复杂的代谢紊乱疾病，主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与胰腺β细胞功能发生障碍。理解这些紊乱的发病机制，对于治疗人类2型糖尿病是非常必要的。利用小鼠作为2型糖尿病的模式动物研究已经有20多年历史，围绕着胰岛素信号通路一系列相关基因进行突变来产生胰岛素抵抗以及β细胞分泌缺陷的相关表型。其中最主要的为胰岛素受体底物(insulin receptor substrates，IRSs)蛋白，通过自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维持细胞正常的生理功能上起到重要的作用。 但是，小鼠模型还是具有很多局限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究目标。作为糖尿病的动物模型，小鼠对于葡糖以及胆固醇食物的反应与人类也存在较大差异。 猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等。并且患有糖尿病的猪与人显示出共同的代谢特点与并发症。目前，人类2型糖尿病会出现相应的心脏血管并发症，这就表明建立一种有价值并且稳定的2型糖尿病模型是非常必需的。 据此，本实验通过RNA干扰技术在猪肝脏细胞中研究IRS基因对糖脂代谢的影响。首先，通过重叠PCR的方法得到了猪IRS-1基因的全长mRNA序列，Real-time PCR检测2d巴马猪15种组织中，IRS1基因的表达情况，结果表明猪肝脏组织中IRS1基因表达量显著高于其它组织，培养猪的肝脏原代细胞系，作为筛选干扰片段的细胞系。将p-Genesil-shIRS1-1-4干扰载体转染猪肝脏细胞，结果表明shIRS1-1为有效干扰片段。然后，通过3'RACE实验克隆了猪IRS2基因的3'非编码区序列，此段序列位于猪11号染色体上，不编码氨基酸，与人IRS2基因3'UTR序列的相似性达到了73.08％，用同样的方法筛选出shIRS2-1为有效干扰片段。利用两个基因的有效干扰片段构建干扰载体p-Genesil-shIRS1/shIRS2，Real-time PCR验证IRS1基因的表达被敲低了78％，IRS2基因的表达被敲低了64％。 肝脏特异性敲除IRS1与IRS2基因的小鼠，会导致胰岛素信号通路的损伤，从而造成糖代谢与脂类代谢的异常，因此本研究检测了在猪的肝脏细胞中同时敲低IRS1与IRS2基因对糖脂代谢的影响。结果表明，在IRS1和IRS2同时敲低的猪肝脏细胞中，两种重要的糖异生作用酶磷酸烯醇丙酮酸激酶(PEPCK)和果糖-1，6-二磷酸酶(F-1，6-BP)的表达都显著上升为对照组的2.46倍与2.96倍，而葡糖激酶(Gck)的表达显著下降。不恰当地激活糖异生作用，往往会伴随着肝脏脂类代谢的异常，我们发现在IRS1和IRS2同时敲低的猪肝脏细胞中，胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1)的表达显著上升了3.0倍，该基因的表达水平可直接反映胆固醇水平。其它调节胆固醇代谢的基因，包括Abcg8和CYP7a1的表达也显著升高。 综上所述，本实验克隆获得了猪IRS1基因的mRNA序列以及猪IRS2基因的部分3'非编码区域序列，并利用shRNA干扰的方法分别将两基因的表达敲低。在猪肝脏细胞水平验证了同时敲低IRS1与IRS2基因之后会导致一系列糖代谢与脂类代谢相关基因表达的异常，可能会引起血糖水平的升高以及胆固醇代谢异常，从而为建立2型糖尿病模型猪奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 糖尿病研究概述

1．1．1 1型糖尿病概述

1．1．2 2型糖尿病概述

1．2 2型糖尿病发病机制

1．2．1 胰岛素信号通路

1．2．2 IRSs基因功能与2型糖尿病

1．3 2型糖尿病动物疾病模型

1．3．1 自发型2型糖尿病动物模型

1．3．2 食物诱导型2型糖尿病动物模型

1．3．3 化学诱导型2型糖尿病动物模型

1．3．4 基因敲除型2型糖尿病动物模型

1．4 2型糖尿病猪模型

1．4．1 诱导型2型糖尿病猪模型

1．4．2 基因修饰型2型糖尿病猪模型

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 组织材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 动物组织DNA提取

2．2．2 提取RNA及反转录

2．2．3 猪IRS1基因的克隆

2．2．4 猪IRS2基因3’UTR区域的克隆

2．2．5 pGenesil-shIRS1／shIRS2干扰载体的构建

2．2．6 猪肝脏原代细胞的培养

2．2．7 Real-time PCR检测糖代谢与脂类相关基因的表达

2．2．8 实验数据分析

3 结果与分析

3．1 猪IRS1基因的克隆及有效干扰片段的筛选

3．1．1 重叠PCR克隆猪IRS1基因

3．1．2 猪IRS1基因结构

3．1．3 猪IRS1基因在各组织中表达

3．1．4 pGenesil-shIRS1干扰载体的构建

3．1．5 猪IRS1基因有效干扰片段的筛选

3．2 猪IRS2基因3’UTR序列的克隆以及有效干扰片段的筛选

3．2．1 猪IRS2基因保守序列的扩增

3．2．2 3’RACE扩增猪IRS2基因部分3’UTR序列

3．2．3 猪IRS2基因在各组织中表达

3．2．4 pGenesil-shIRS2干扰载体的构建

3．2．5 猪IRS2基因有效干扰片段的筛选

3．3 pGenesil-shIRS1／shIRS2干扰载体的构建

3．3．1 hU6启动子的克隆

3．3．2 构建pGenesil-shIRS1／shIRS2干扰载体

3．4 猪肝脏细胞中同时敲低IRS1和IRS2基因对糖代谢的影响

3．5 猪肝脏细胞中敲低IRS1和IRS2基因对胆固醇代谢的影响

4 讨论

4．1 猪IRS1和IRS2基因的克隆和表达

4．2 RNAi对猪IRS1和IRS2基因表达的敲低

4．3 胰岛素受体底物的敲低对猪肝脏细胞代谢的影响

4．3．1 对葡糖代谢的影响

4．3．2 对脂类代谢的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文