一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系及其构建方法

摘要

本发明涉及一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST‑KDABHD16A细胞系及其构建方法，通过在线设计网站设计猪abhd16a基因的shRNA序列，构建至慢病毒载体PLKO.1‑puro，与双质粒系统逆病毒包装质粒pCMV‑Gag‑Pol、pCVM‑VSV‑G慢病毒通过人HEK293T/17细胞组装获得慢病毒；经过纯化和浓缩后的慢病毒感染ST细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲低abhd16a的ST‑KDABHD16A细胞株。并通过实时荧光定量PCR检测细胞株中abhd16a mRNA表达水平，通过免疫印迹法检测敲减细胞株中ABHD16A蛋白水平的表达。本发明以猪易感细胞系ST细胞为模型，利用慢病毒为工具，构建出稳定敲低猪的abhd16a细胞系ST‑KDABHD16A，为研究猪abhd16a在抵御病毒入侵机制及免疫过程中发挥的作用，以及为感染乙型脑炎病毒后引起的繁殖障碍研究提供新的实验材料。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系及其构建方法。

背景技术

人含有α/β水解酶结构域的ABHD家族蛋白是典型的丝氨酸代谢酶，被认为是代谢调节和疾病发生和发展过程中的关键因子。已有的研究报道表明人ABHD16A家族的蛋白显示出酯酶、蛋白酶、过氧化物酶、氧化物水解酶和脱卤酶等多种酶活性，与脂代谢、细胞信号转导及多种代谢障碍等有关[1]。ABHD16A在多个哺乳动物中氨基酸序列高度保守，鼠ABHD16A被发现是在睾丸、心脏、肌肉和脑中发现的小鼠组织中具有最高mRNA转录水平的完整膜蛋白。并且ABHD16A具有酰基甘油脂肪酶、磷脂酰丝氨酸脂肪酶活性，被表征为一个PG-G水解酶。人ABHD16A多态性分析显示与川崎病和冠状动脉瘤易感性有关，猪ABHD16A中的单核苷酸多态性与背部脂肪厚度有关，这些研究结果表明ABHD16A可能参与脂肪组织功能和脂质代谢，ABHD16A有成为研究猪的背膘脂肪的一个重要的分子靶标蛋白。

Cai等发现CoroMarker、lnc-BAT5、IL21R-AS1作为候选CAD生物标志物。Kim揭示ABHD16A与ABHD12一起揭示了lyso-PS的体内调节，为调节神经炎症反应提供了潜在的酶促靶标。ABHD16A可能作为PG-G水解酶，在嗜中性粒细胞中调节PG-G和PG平衡来调节免疫。流行性乙型脑炎(Epidemic encephalitis B)又称日本脑炎(Japanese encephalitis)，是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染而引发的一种危害严重的人畜共患传染病。猪作为JEV病毒在自然界主要的储存宿主和传播宿主，在性成熟时为主要的发病易感群体，主要引起对生殖系统的障碍，主要包括怀孕母猪繁殖障碍(流产)，公猪睾丸炎，以及幼猪的脑炎，推测猪ABHD16A在乙型脑炎入侵引起的炎症反应中起到关键作用。

发明内容

本发明的目的是以猪易感细胞系ST(swine testis)细胞为模型，利用慢病毒为工具，构建出稳定敲低猪ABHD16A的细胞系ST-KDABHD16A，为研究猪abhd16a在抵御病毒入侵机制及免疫过程中发挥的作用，以及为感染乙型脑炎病毒后引起的繁殖障碍研究提供新的实验材料。

本发明为实现上述技术目的，采用的技术方案是：所述细胞系为猪易感病毒猪睾丸(swine testis)稳定敲低与病毒和细胞免疫有关的猪abhd16a细胞。

一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)、猪abhd16a shRNA设计：根据克隆猪abhd16a序列设计并合成shRNA引物，根据PLKO.1-puro载体酶切位点设计茎环结构，并合成构建慢病毒载体PLKO.1-puro所需序列；

2)、PLKO.1-shRNApigabhd16a载体的构建：提取PLKO.1-puro载体，通过双酶切体系线性化质粒，得到PLKO.1-puro双酶切后质粒；

将shRNA引物退火后与ddH2O、PLKO.1-puro双酶切后质粒、T4 DNA Ligase以及T4DNALigase Buffer反应，然后取反应得到的连接反应产物转化大肠杆菌stbl3感受态，筛选，挑取阳性克隆子进行菌液PCR验证，引物为SEQ ID NO.1-2，然后将阳性克隆子进行扩大培养提取质粒，进行KpnⅠ单酶切验证，再进行测序验证，验证完成即获得PLKO.1-shRNApigabhd16a载体；

4)、细胞培养与慢病毒包装与浓缩：取HEK293T/17细胞培养并转染PLKO.1-shRNApigabhd16a载体；转染后收集上清液过滤得到病毒初始液，然后加入PEG-8000、NaCl混合，离心、弃上清液，并用DMEM溶解慢病毒沉淀，收集悬液得到慢病毒原液，储存，并进行慢病毒滴度测定；

4)、慢病毒感染ST细胞和细胞筛选

取ST细胞，培养并转染慢病毒原液，然后进行细胞筛选，并将筛选后的细胞进行单克隆化，再将单克隆化后的细胞扩大培养；

5)、实时荧光定量PCR和检测猪abhd16a敲低细胞ST-KDABHD16A的表达情况

将步骤4)扩大培养的细胞提取敲减细胞系的RNA，以猪Hprt-1为内参基因，序列为SEQ ID NO.3-4，荧光定量PCR检测猪abhd16a，引物为SEQ ID NO.5-6，，检测abh16a mRNA表达量；然后将ST-KDABHD16A敲减细胞株裂解，检测ABHD16A蛋白的表达情况。

作为本发明一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法的进一步优化，所述步骤2)中shRNA引物退火后与ddH2O、PLKO.1-puro双酶切后质粒、T4DNALigase以及T4 DNALigase Buffer在4℃条件下反应8-18h。

作为本发明一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法的进一步优化，所述步骤2)中挑取阳性克隆子进行菌液PCR验证的反应条件为：先预变性5min，包括95℃条件下反应30s，44℃条件下反应30s，72℃条件下反应20s，共进行35个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

作为本发明一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法的进一步优化，所述步骤2)中进行KpnⅠ单酶切验证的反应条件为37℃反应1h，然后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

作为本发明一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法的进一步优化，所述步骤3)中HEK293/17细胞培养和传染的具体方法为：将HEK293T/17细胞置于含有质量浓度为10％FBS的高糖DMEM中，并置于培养于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，转染前一天，将生长旺盛、生长状态较好的HEK293T/17细胞铺板至六孔板中，24h以内，采用脂质体POLOdeliverer 3000转染试剂进行转染，每孔转染2μg混合质粒，混合质粒分别为0.8μg pCMV-Gag-Pol、0.2μg pCMV-VSV-G和1μgPLKO.1-shRNApigabhd16a，以转染0.8μg pCMV-Gag-Pol、0.2μg pCMV-VSV-G和1μg PLKO.1-puro空载体为对照组。

作为本发明一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法的进一步优化，所述步骤4)中慢病毒感染ST细胞和细胞筛选的具体方法为：转染前一天，将生长状态良好的ST细胞以每孔6×104个细胞铺板于24孔板，24h后去除培养基，每孔加入0.25mL慢病毒原液和0.25mL新鲜完全培养基，培养24h后更换新鲜培养基，培养至72h；更换含有3mg/mL嘌呤霉素的完全培养基，之后每24h更换一次含有嘌呤霉素的完全培养基，连续培养7d，将筛选后的细胞采用有限稀释法传代于96孔板中，采用含有1mg/mL的嘌呤霉素完全培养基单克隆化筛选后的细胞，将单克隆化后的细胞扩大培养。

作为本发明一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法的进一步优化，所述步骤5)中检测猪abhd16a敲低细胞的表达情况的具体方法为：将在24孔板中培养24h后的ST-KDABHD16A敲减细胞株采用RAPI裂解液裂解细胞，以ABHD16A抗体和HPRT-1为一抗，western blot检测ABHD16A蛋白表达。

有益效果

本发明通过在线设计猪abhd16a基因的shRNA序列，构建至慢病毒载体PLKO.1-puro，与双质粒系统逆病毒包装质粒pCMV-Gag-Pol、pCVM-VSV-G慢病毒通过人HEK293T/17细胞组装获得慢病毒；经过纯化和浓缩后的慢病毒感染ST细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲低abhd16a的ST-KDABHD16A细胞株。通过实时荧光定量PCR检测细胞株中abhd16a mRNA表达水平，通过免疫印迹法(western blot)检测敲减细胞株中ABHD16A蛋白水平的表达。最终成功构建猪abhd16a慢病毒敲减载PLKO.1-shRNApigabhd16a载体；浓缩的慢病毒感染ST细胞，成功筛选出ST-KDABHD16A细胞株，实时荧光定量PCR结果显示abhd16a基因mRNA水平表达水平下调，western blot检测敲减细胞株中ABHD16A蛋白表达量减少。

本发明以猪易感细胞系ST细胞为模型，利用慢病毒为工具，构建出稳定敲低猪abhd16a的ST-KDABHD16A细胞系，为研究猪abhd16a在抵御病毒入侵机制及免疫过程中发挥的作用，以及为感染乙型脑炎病毒后引起的繁殖障碍研究提供新的实验材料。

附图说明

图1为本发明中猪abhd16a shRNA设计图；

图2为本发明中质粒提取PLKO.1-puro载体后经过限制性内切酶EcoRⅠ、AgeⅠ双酶切后，回收双酶切后载体PLKO.1-puro示意图；

图3为本发明中合成的shRNA序列连接至PLKO.1-puro后得到的阳性克隆子经菌液PCR验证结果图；

图4为本发明中菌液PCR验证得到的阳性克隆扩增提取质粒采用KpnⅠ单酶切的验证图；

图5为本发明实时荧光定量PCR检测敲减细胞株中abhd16a基因的相对表达量结果图；

图6为本发明检测ST敲减abhd16a后蛋白水平表达图。

具体实施方式

一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系的构建方法

使用的材料和主要试剂如下：PLKO.1-puro质粒，pCMV-Gag-Pol、pCMV-VSV-G慢病毒包装质粒，DH5α(E.coli)、stbl3感受态，HEK293T/17细胞，ST细胞由河南农业大学生命科学院实验室保存(HEK293T/17细胞和ST细胞均为市售生物材料，无需提供遗传资源来源披露登记表)。DMEM购自美国HyClone公司DMEM高糖培养基，胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。2×Taq DNA聚合酶购自大连宝生物，限制性内切酶购自NEB，HiScriptⅡReverse Transcriptase反转录试剂盒购自诺维赞，质粒小量提取试剂盒及DNA琼脂糖凝胶回收等试剂盒均购自TIANGEN公司。卡那霉素、氨苄青霉素等购自鼎国生物工程公司，POLOdeliverer 3000转染试剂购自上海锐赛公司，嘌呤霉素(2mg/mL)、蛋白分子Marker、HRP染色试剂盒购自索莱宝公司，PVDF膜，ABHD16A抗体(本实验室制备)，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，其它一般试剂均为市售分析纯(AR)。

具体实验方法如下

1)、猪abhd16a shRNA设计

根据本实验室克隆猪abhd16a序列(GenBank:KX068708.1)，通过在线设计网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)，通过设计我们得到猪abhd16a shRNA序列。根据PLKO.1-puro载体酶切位点设计茎环结构，序列交与北京华大基因有限公司合成。

2)、PLKO.1-shRNApigabhd16a载体的构建

由质粒提取试剂盒提取PLKO.1-puro载体，通过双酶切体系：1μLEcoRⅠ+1μL AgeⅠ+5μL 10×NEB Cutsmart Buffer+1μg PLKO.1-puro+ddH2O(up to 50μL)质粒，37℃，1h，双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收双酶切后载体。

根据公司合成的shRNA引物溶解为终浓度100μM，进行退火反应(4μL Oligo F+4μLOligo R+8μL 5×NEB Buffer，沸水浴5min，自然降至室温)。反应结束后在PCR反应管中加入:3μL ddH2O、20ng PLKO.1-puro双酶切后质粒、1μL T4DNA Ligase、2μL T4 DNA LigaseBuffer；4℃反应过夜。

取连接反应产物转化stbl3感受态，经LB(Amp)平板筛选过夜后，挑去阳性克隆子进行菌液PCR验证，菌液PCR验证引物为SEQ ID NO.1-2，PLKO.1-F:5’-GACTATCATATGCTTACCGT-3’；PLKO.1-R:5’-ATTCTTTAGTTTGTATGT-3’，PCR反应程序：5μL 2×Taq DNA Mix+0.3μL PLKO.1-F+0.3μL PLKO.1-R+1μL菌液。反应条件为：95℃预变性5min，(95℃，30s；44℃，30s；72℃，20s)×35个循环，72℃延伸10min。2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将阳性克隆子进行扩大培养提取质粒，进行KpnⅠ进行单酶切验证：1μL KpnⅠ+5μL 10×NEB Cutsmart Buffer+1μg阳性克隆子质粒+ddH2O(up to 50μL)，37℃反应1h，1％琼脂糖凝胶电泳检测。将验证后的阳性克隆子送至北京华大基因有限公司测序验证。

3)、细胞培养与慢病毒包装与浓缩

ST、HEK293T/17细胞在含有10％FBS的高糖DMEM，培养于37℃、5％CO2培养箱。本研究采用脂质体POLOdeliverer 3000方法转染细胞。将生长旺盛、生长状态较好的HEK293T/17细胞转染前一天将1×105细胞铺板至六孔板中，24h以内，采用脂质体POLOdeliverer3000转染试剂，每孔转染2μg混合质粒(0.8μg pCMV-Gag-Pol+0.2μg pCMV-VSV-G+1μgPLKO.1-shRNApigabhd16a)，以转染：0.8μg pCMV-Gag-Pol+0.2μg pCMV-VSV-G+1μgPLKO.1-puro)空载体为对照组。

转染12h后，每六孔板加入1.5mL新鲜完全培养基，转染48h后收取一次培养上清，保存于4℃，之后再次更换新鲜培养基1mL至转染后72h，再次收集培养上清，将两次收集培养上清混匀后，用0.44μM过滤后，每4mL过滤后的病毒初始液，加入5×PEG-8000+NaCl母液1mL，4℃，每20-30min混合一次，共进行3-5次，之后4℃放置过夜。次日，4℃，4000g，离心20min，吸弃上清，静置5min，吸走残余液体，加入100μL的DMEM溶解慢病毒沉淀，病毒悬液分装成10μL每份，液氮速冻后储存在-80℃。

慢病毒滴度的测定，将生长状态良好的HEK293T/17铺板于24孔板，梯度浓度稀释感染细胞，测定包装慢病毒滴度。

4)、慢病毒感染ST细胞和细胞筛选

将生长状态较好的ST细胞于转染前一天每孔6×104个细胞铺板在24孔板，24h后去除培养基，每孔加入0.25mL病毒原液+0.25mL新鲜完全培养基，培养24h后更换新鲜培养基，培养至72h。更换含有3mg/mL嘌呤霉素的完全培养基。之后每24h更换一次含有嘌呤霉素的完全培养基。连续培养7d，将筛选后的细胞采用有限稀释法传代于96孔板中，采用含有1mg/mL的嘌呤霉素完全培养基单克隆化筛选后的细胞，将单克隆化后的细胞扩大培养。

5)、实时荧光定量PCR和western blot检测猪abhd16a敲低细胞ST-KDABHD16A

将单克隆化后的细胞培养按照每孔6×104个细胞铺板在24孔板，培养24h后采用TRIZOL法提取敲减细胞系的RNA，以SEQ ID NO.3-4猪Hprt-1(F：GGACTTGAATCATGTTTGTG；R：CAGATGTTTCCAAACTCAAC)为内参基因，以SEQ ID NO.5-6为引物，荧光定量PCR检测猪abhd16a (F：GACTCAGAAAGGGCCGCGT；R：GACTCAGAAAGGGCCGCGT)，检测abh16amRNA表达水平。

将在24孔板中培养24h后的ST abhdl6a敲减细胞株采用RAPI裂解液裂解细胞，以ABHD16A抗体(1∶3000)、HPRT-1(1：4000)为一抗，western blot检测ABHD16A蛋白表达。

结果如下

1)、猪abhd16a shRNA设计结果

根据在线网站设计结果如图1，将shRNA靶序列按照PLKO.1-puro设计合成引物如表1。

表1猪abhd16a shRNA引物合成表

2)、PLKO.1-shRNApigabhd16a载体构建的结果

质粒提取PLKO.1-puro载体后经过限制性内切酶EcoRⅠ、AgeⅠ双酶切后，回收双酶切后载体PLKO.1-puro如图2，将合成的shRNA序列连接至PLKO.1-puro后，得到的阳性克隆子经菌液PCR验证结果如图3，将菌液PCR验证得到的阳性克隆扩增提取质粒，用KpnⅠ单酶切验证如图4，之后将单酶切验证后的阳性克隆子测序，测序结果与设计序列一致。

图2：质粒提取PLKO.1-puro和双酶切后(M：1Kb DNA Ladder；1：PLKO.1-puro质粒；2：PLKO.1-puro质粒EcoRⅠ，AgeⅠ双酶切)；图3：PLKO.1-shRNApigabhd16a菌液PCR验证(M：DM2000 DNA Maker；1：PLKO.1-puro；2：control；3-8：PLKO.1-puro-shRNAsabhd16a)；图4：PLKO.1-shRNApigabhd16a克隆子KpnⅠ单酶切验证(M：1Kb DNA Ladder；1-4：PLKO.1-shRNApigabhd16a)

3)、实时荧光定量PCR和western blot检测敲减细胞株ST-KDABHD16A

实时荧光定量PCR检测以HPRT-1为内参基因，检测敲减细胞株中abhd16a基因的相对表达量如图5，结果显示在ST细胞中abhd16a mRNA表达水平显著降低(p<0.01)。以HPRT-1为内参蛋白，检测ST敲减ABHD16A后，蛋白水平如图6，结果表明，在敲减细胞株中，ABHD16A蛋白水平显著降低。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种稳定敲低猪abhd16a基因的ST-KDABHD16A细胞系及其构建方法

<141> 2021-04-21

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