AI-2的体外合成及其对植物乳杆菌细菌素合成的影响

摘要

植物乳杆菌KLDS1.0391是一株分离自内蒙古传统发酵乳制品并且能产细菌素（植物乳杆菌素MG）的菌株，其所产细菌素对G+和G-菌都有较好的抑制作用。前期研究结果显示:该菌株中存在AI-2(autoinducer-2)介导的群体感应调控系统，且信号分子AI-2在该菌株与其他乳酸菌共培养时细菌素的合成中起重要调节作用，AI-2的生物合成途径已经非常明确，S-腺苷高半胱氨酸(SAH)经Pfs（S-腺苷高半胱氨酸核苷酶）和LuxS（S-核糖高半胱氨酸裂解酶）蛋白催化可生成AI-2。为研究AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的调控作用，本课题组前期已经成功构建了原核表达载体pQE-30-luxS和pQE-30-p，并在大肠杆菌M15中成功表达出重组蛋白质LuxS和Pfs，为AI-2的体外合成奠定了基础。
　　本论文主要针对重组蛋白质LuxS和Pfs的诱导表达及纯化条件进行优化，并进一步优化AI-2的体外合成条件，最终体外合成具有生物活性的AI-2。在此基础上研究外源添加AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391生长、细菌素合成的影响，并采用实时荧光定量PCR技术分析细菌素结构基因plnEF的差异表达。具体实验结果如下:
　　(1)采用单因素实验，优化重组蛋白质LuxS和Pfs诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度，确定最佳诱导表达条件为:以LB培养基为诱导培养基，诱导前菌液OD600为0.6～0.8，IPTG浓度为0.1mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为12h。
　　(2)采用Ni-NTA Purification System对重组蛋白质LuxS和Pfs进行纯化，优化重组蛋白质LuxS和Pfs的纯化条件，确定LuxS蛋白的最佳纯化条件为:采用添加3mol/L NaCl的PBS缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液，含500mmol/L咪唑的Native Elution Buffer(pH6.5)作为蛋白洗脱液对蛋白进行纯化。Pfs蛋白的最佳纯化条件为:采用PBS缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液，含250mmol/L咪唑的Native Elution Buffer(pH8.0)作为蛋白洗脱液对蛋白进行纯化。
　　(3)在优化的诱导表达及纯化条件下，诱导表达并纯化重组蛋白质LuxS和Pfs，获得的重组蛋白质LuxS和Pfs的浓度分别为5.23mg/mL和6.71mg/mL，利用获得的重组蛋白质成功合成了AI-2，表明得到的重组蛋白质具有生物活性。
　　(4)采用单因素实验，优化AI-2体外合成的反应温度、pH、酶浓度、孵育时间，确定AI-2的最佳体外合成条件为:2mmol/L SAH，1mg/mL LuxS蛋白，0.5mg/mL Pfs蛋白，pH7.5，37℃孵育5h。利用优化的合成条件，成功合成具有生物活性的AI-2，活性约为阳性对照的2倍，浓度约为2mmol/L。
　　(5)在MRS培养基中添加合成的AI-2，接种植物乳杆菌KLDS1.0391后培养，发现菌体生长速率无明显变化，细菌素产量显著增加(P＜0.01)，且AI-2添加量不同对细菌素合成的促进作用也不同，3％(v/v)添加量的促进作用显著大于1％和5％的添加量(P＜0.01)。
　　(6)植物乳杆菌KLDS1.0391在添加3％(v/v)AI-2的MRS培养基中37℃培养15h后，采用实时荧光定量PCR分析植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素结构基因plnEF的转录水平，发现plnEF表达量上调至空白对照的2.89倍，差异极显著（P＜0.01）。
　　结论:本课题成功优化了重组蛋白质LuxS和Pfs的诱导表达和纯化条件，成功优化了AI-2的体外合成条件。在获得的最优条件下，通过诱导表达和纯化得到重组蛋白质，并利用获得的重组蛋白质体外成功合成AI-2。AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391的细菌素合成存在明显正调控作用;AI-2添加量不同，对细菌素合成量的调控效果也不同。AI-2对植物乳杆菌生长无明显影响。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 细菌素的概述

1．2．1 细菌素的定义与分类

1．2．2 细菌素的应用

1．3 发酵条件对乳酸菌细菌素产量的影响

1．3．1 培养基成分对细菌素产量的影响

1．3．2 培养条件对细菌素产量的影响

1．3．3 有机溶剂对细菌素产量的影响

1．3．4 群体感应现象对细菌素产量的影响

1．4 群体感应简介

1．4．1 群体感应的发现

1．4．2 群体感应的定义及分类

1．5 AI-2信号分子概述

1．5．1 AI-2信号分子的生物合成途径

1．5．2 AI-2信号分子生物活性的检测

1．5．3 AI-2信号分子的调控作用研究现状

1．6 本研究的目的与意义

1．7 本研究采用的技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 工具酶、Marker和试剂盒

2．1．3 培养基

2．1．4 主要试剂

2．1．5 常用溶液的配制

2．1．6 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 重组蛋白质LuxS和Pfs诱导表达条件的优化

2．2．2 重组蛋白质LuxS和Pfs存在形式的检测

2．2．3 重组蛋白质LuxS纯化条件的优化

2．2．4 重组蛋白质Pfs纯化条件的优化

2．2．5 优化条件下重组蛋白质LuxS和Pfs的制备

2．2．6 AI-2体外合成条件的优化

2．2．7 优化条件下AI-2的体外合成

2．2．8 植物乳杆菌培养上清液中AI-2活性检测方法的优化

2．2．9 AI-2添加对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响

2．2．10 AI-2对细菌素结构基因plnEF转录水平的影响

2．2．11 数据分析

3 结果与分析

3．1 重组蛋白质LuxS和Pfs诱导表达条件的优化

3．1．1 诱导培养基的确定

3．1．2 诱导温度的确定

3．1．3 诱导前菌体生物量的确定

3．1．4 诱导时间的确定

3．1．5 诱导剂IPTG浓度的确定

3．2 重组蛋白质LuxS和Pfs存在形式的检测

3．3 重组蛋白质LuxS纯化条件的优化

3．3．1 Native Elution Buffer咪唑浓度的优化

3．3．2 Native Elution Buffer pH的优化

3．3．3 结合缓冲液的选择

3．4 重组蛋白质Pfs纯化条件的优化

3．5 优化条件下重组蛋白质LuxS和Pfs的制备

3．5．1 重组蛋白质LuxS和Pfs的诱导表达及纯化

3．5．2 重组蛋白质LuxS和Pfs的透析、浓缩及定量

3．5．3 重组蛋白质LuxS和Pfs生物活性的检测

3．6 AI-2体外合成条件的优化

3．6．1 AI-2浓度测定标准曲线的绘制

3．6．2 AI-2体外合成最适温度的确定

3．6．3 AI-2体外合成最适pH的确定

3．6．4 AI-2体外合成最佳酶浓度的确定

3．6．5 AI-2体外合成孵育时间的确定

3．7 优化条件下AI-2的体外合成

3．8 植物乳杆菌培养上清液中AI-2活性检测方法的优化

3．8．1 植物乳杆菌纯培养上清液AI-2的活性

3．8．2 培养上清液加样比例的确定

3．9 AI-2 添加对植物乳杆菌生长和细菌素合成的影响

3．9．1 添加AI-2对植物乳杆菌KLDS1．0391生长的影响

3．9．2 AI-2添加量对细菌素合成量的影响

3．9．3 植物乳杆菌KLDS1．0391生长过程中AI-2活性的变化

3．9．4 细菌素合成动力学分析

3．10 AI-2对细菌素结构基因plnEF转录水平的影响

3．10．1 引物的设计与验证

3．10．2 总RNA的提取

3．10．3 细菌素结构基因的差异表达

4 讨论

4．1 重组蛋白质LuxS和Pfs的诱导表达

4．2 重组蛋白质LuxS和Pfs的纯化

4．3 AI-2体外合成

4．4 植物乳杆菌发酵上清液AI-2活性的检测

4．5 AI-2对植物乳杆菌KLDS1．0391细菌素合成的作用分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文