14-3-3γ对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成和细胞增殖的调节

摘要

奶牛的乳品质是衡量经济效益的重要标准。乳蛋白的含量是牛奶品质的一个重要指标。我国奶牛普遍存在乳蛋白含量偏低的重大问题，因此亟需阐明乳蛋白合成的机理，从而找到改善乳品质的有效技术途径。乳蛋白合成机理是分子生物学和泌乳生理学领域重要的课题之一。目前研究已经取得了很多重大的进展，证实了JAK/Stat5和mTOR/S6K1信号途径对于乳蛋白转录和翻译是至关重要的。另外，乳蛋白合成还直接受到乳腺上皮细胞生长和增殖情况的影响。14-3-3蛋白广泛分布于各种生物体组织和细胞中，参与很多生物学过程，包括细胞生长、细胞周期、细胞增殖、代谢、信号转导、基因转录和蛋白质合成。14-3-3蛋白决定其底物的亚细胞定位，以促进或抑制信号转导，包括mTOR也能够被14-3-3调节。14-3-3蛋白具有不同的功能，并与很多底物发生相互作用。尽管进行了广泛的研究，但14-3-3对蛋白质合成以及细胞增殖发挥调节作用的具体机制仍需进行深入探索。本实验室前期通过蛋白质双向电泳和质谱鉴定分析发现14-3-3γ与乳蛋白合成相关，提示14-3-3γ可能参与乳蛋白合成的调控过程。本研究针对14-3-3γ的泌乳调节功能、细胞增殖调节功能、相互作用蛋白鉴定等进行分析，旨在揭示14-3-3γ通过互作蛋白调控乳蛋白合成和细胞增殖的分子机理。
　　实验首先采用免疫荧光技术检测了细胞中cytokeratin18和β-酪蛋白的表达，以鉴定奶牛乳腺上皮细胞的纯度和泌乳功能。添加浓度为0.6mM的蛋氨酸处理细胞24h，通过westernblotting技术检测蛋氨酸对14-3-3γ和β-酪蛋白表达的影响。利用免疫荧光技术检测蛋氨酸对14-3-3γ表达的影响。采用Casy(@) Model DT细胞计数仪检测蛋氨酸刺激对细胞数和细胞活力的影响。采用流式细胞术检测添加蛋氨酸后细胞的增殖率和周期的变化。进一步构建14-3-3γ的真核表达载体进行14-3-3γ过表达实验，合成14-3-3γ的抑制片段进行抑制实验。通过western blotting技术检测了14-3-3γ过表达和抑制后mTOR、p-mTOR、Stat5a、p-Stat5a、CyclinD1和β-酪蛋白蛋白质水平的变化。利用免疫荧光技术检测了14-3-3γ过表达和抑制后对p-mTOR和p-Stat5a水平的影响。采用Casy(@) Model DT细胞计数仪和流式细胞术检测14-3-3γ过表达和抑制对细胞数、细胞活力、细胞增殖率和细胞周期的影响。实验进一步通过免疫共沉淀和质谱鉴定技术寻找与14-3-3γ相互作用并且与乳蛋白合成有关的蛋白质，并探究14-3-3γ过表达和抑制对互作蛋白表达的影响，以及过表达互作蛋白后乳蛋白合成的变化。
　　本研究确定了蛋氨酸对14-3-3γ表达和细胞增殖的影响。结果显示加蛋氨酸组的细胞中14-3-3γ和β-酪蛋白表达量显著高于空白对照组。加蛋氨酸使乳腺上皮细胞数明显增加，且细胞活力显著增强。此外，加蛋氨酸组的乳腺上皮细胞增殖率显著高于空白对照组，加蛋氨酸组的处于S期和G2-M期的乳腺上皮细胞百分比均明显升高，而G0-G1期细胞百分比明显下降。这表明乳蛋白合成和细胞增殖与14-3-3γ有关。
　　本实验进一步检测了14-3-3γ过表达和抑制对乳蛋白合成和细胞增殖的影响。结果显示14-3-3γ过表达可以上调mTOR、Stat5a和β-酪蛋白的蛋白质表达水平，并促进mTOR和Stat5a两个蛋白发生磷酸化，而抑制实验结果与过表达相反。过表达14-3-3γ使细胞数明显增加，且细胞活力显著增强。此外，过表达14-3-3γ的乳腺上皮细胞增殖率显著高于空白对照组和转染空载体组，且处于S期和G2-M期的细胞百分比均明显升高，而G0-G1期细胞百分比明显下降。抑制实验结果与过表达相反。另外，过表达和抑制14-3-3γ基因的结果显示，14-3-3γ正调节Cyclin D1的表达。以上实验结果表明14-3-3γ正向调节mTOR和Stat5a的磷酸化水平从而促进乳蛋白合成和细胞增殖。
　　本实验对14-3-3γ相互作用蛋白进行了鉴定，共鉴定出44种蛋白质与14-3-3γ相互作用，分为8类:与转录、翻译、信号转导、细胞增殖、细胞周期、细胞骨架和转运相关的蛋白以及酶类。蛋白质翻译对于乳蛋白合成至关重要，因此在翻译相关蛋白中选择了eIF1AX、RPS7和eIF5这3个蛋白作为研究对象，验证它们与14-3-3γ蛋白是否真的存在相互作用。实验利用western blotting、免疫荧光共定位和荧光能量共振转移技术对eIF1AX、RPS7和eIF5与14-3-3γ之间是否存在直接的相互作用进行了验证。结果发现eIF1AX、RPS7和eIF5这3个蛋白与14-3-3γ蛋白是特异性结合的，3个蛋白与14-3-3γ蛋白共定位指数均在90％以上，3个蛋白与14-3-3γ蛋白的FRET效率均在20％-35％，显著高于对照组(＜5％)。这表明eIF1AX、RPS7和eIF5这3个蛋白与14-3-3γ蛋白均存在直接的相互作用，14-3-3γ蛋白调节泌乳的功能很可能与这3个互作蛋白有关。
　　本研究进一步检测了蛋氨酸对eIF1AX、RPS7和eIF5表达的影响。结果表明，添加蛋氨酸后，细胞中eIF1AX、RPS7、eIF5和β-酪蛋白的表达量均显著升高，这说明eIF1AX、RPS7和eIF5这3个蛋白可能与乳蛋白合成有关。
　　本实验又检测了14-3-3γ过表达和抑制对eIF1AX、RPS7和eIF5表达的影响。结果发现，过表达14-3-3γ基因后，细胞中eIF1AX、RPS7和eIF5的表达量均显著增加，而抑制14-3-3γ基因后，细胞中eIF1AX、RPS7和eIF5的表达量均显著降低。此外，14-3-3γ基因过表达可显著提高eIF2α的表达量并显著降低p-eIF2α的水平，而14-3-3γ基因抑制的结果与过表达相反。eIF1AX、RPS7和eIF5三个基因分别过表达均导致eIF2α和β-酪蛋白的表达量显著增加，而p-eIF2α的水平明显降低。上述结果表明，14-3-3γ通过调节eIF1AX、RPS7和eIF5蛋白的表达水平，从而调节乳蛋白合成和细胞增殖。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺发育与泌乳

1．2 奶牛泌乳功能基因组学研究进展

1．3 其他功能基因的研究进展

1．4 奶牛乳蛋白合成相关信号通路

1．4．1 JAK-Stat5信号通路

1．4．2 mTOR信号通路

1．5 氨基酸对泌乳的调节作用

1．6 14-3-3蛋白的研究进展

1．6．1 14-3-3蛋白简介

1．6．2 14-3-3蛋白的结构

1．6．3 14-3-3蛋白调控细胞周期

1．6．4 14-3-3蛋白调节细胞信号转导

1．6．5 14-3-3γ蛋白的生物学功能

1．7 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 实验动物与细胞

2．2 乳腺上皮细胞的培养纯化与鉴定

2．2．1 乳腺上皮细胞的培养纯化

2．2．2 乳腺上皮细胞的鉴定

2．3 添加Met对14-3-3γ表达和细胞增殖的影响

2．3．1 添加Met对14-3-3γ表达的影响

2．3．2 添加Met对细胞增殖的影响

2．4 14-3-3γ对泌乳信号通路及细胞增殖的影响

2．4．1 14-3-3γ过表达对泌乳相关蛋白的影响

2．4．2 14-3-3γ过表达对细胞增殖的影响

2．4．3 14-3-3γ抑制对泌乳相关蛋白的影响

2．4．4 14-3-3γ抑制对细胞增殖的影响

2．5 14-3-3γ的互作蛋白分析

2．5．1 免疫共沉淀分析14-3-3γ的互作蛋白

2．5．2 14-3-3γ与eIF1AX、RPS7和eIF5互作的WB验证

2．5．3 14-3-3γ与eIF1AX、RPS7和eIF5的共定位分析

2．5．4 FRET分析14-3-3γ的相互作用蛋白

2．5．5 WB检测Met对互作蛋白表达的影响

2．5．6 IF检测Met对互作蛋白表达的影响

2．5．7 WB检测14-3-3γ过表达对相关蛋白表达的影响

2．5．8 IF检测14-3-3γ过表达对互作蛋白表达的影响

2．5．9 WB检测14-3-3γ抑制对相关蛋白表达的影响

2．5．10 IF检测14-3-3γ抑制对互作蛋白表达的影响

2．5．11 互作蛋白过表达对翻译和细胞增殖的影响

2．6 数据分析

3 结果与分析

3．1 乳腺上皮细胞的培养与鉴定

3．2 添加Met对14-3-3γ表达和细胞增殖的影响

3．2．1 WB检测Met对14-3-3γ和β-酪蛋白表达的影响

3．2．2 IF检测添加Met对14-3-3γ表达的影响

3．2．3 添加Met对细胞增殖的影响

3．3 14-3-3γ过表达对泌乳信号通路及细胞增殖的影响

3．3．1 pGCMV-IRES-EGFP-14-3-3γ过表达载体的构建及细胞转染

3．3．2 14-3-3γ过表达对相关蛋白的影响

3．3．3 14-3-3γ过表达对细胞增殖的影响

3．4 14-3-3γ抑制对泌乳信号通路及细胞增殖的影响

3．4．1 14-3-3γ抑制对相关蛋白的影响

3．4．2 14-3-3γ抑制对细胞增殖的影响

3．5 14-3-3γ的互作蛋白分析

3．5．1 免疫共沉淀分析14-3-3γ的互作蛋白

3．5．2 14-3-3γ与eIF1AX、RPS7和eIF5的共定位分析

3．5．3 FRET验证14-3-3γ的相互作用蛋白

3．5．4 WB检测添加Met对相关蛋白表达的影响

3．5．5 IF检测Met对互作蛋白表达的影响

3．5．6 14-3-3γ过表达后对相关蛋白的影响

3．5．7 14-3-3γ抑制后对相关蛋白的影响

3．5．8 互作蛋白过表达对相关蛋白的影响

3．6 14-3-3γ调节乳蛋白合成和细胞增殖的机理

4 讨论

4．1 蛋氨酸对14-3-3γ表达的影响

4．2 14-3-3γ对泌乳信号通路的影响

4．3 14-3-3γ与eIF1AX、RPS7和eIF5相互作用

4．3．1 eIF1AX的功能简介

4．3．2 RPS7的功能简介

4．3．3 eIF5的功能简介

4．3．4 14-3-3γ通过互作蛋白调节乳蛋白合成

4．3．5 14-3-3γ通过互作蛋白调节细胞增殖

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文