甘氨酰tRNA合成酶对奶牛乳腺上皮细胞乳合成及细胞增殖的影响

摘要

随着人们对食品安全认识的不断加深，使得乳品质的好坏和产奶量的高低得到更广泛的关注。研究泌乳相关信号通路，探寻与泌乳相关的重要调控分子，有利于为奶牛乳品质和乳产量的提高，提供实验依据及新途径。甘氨酰tRNA合成酶（GlyRS）是重要的氨基酰tRNA合成酶（aaRSs）家族成员。研究发现aaRSs存在多种经典翻译功能之外的信号调控作用。但是，目前国内外关于GlyRS在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究尚未见报道。本实验室前期发现GlyRS与BMECs乳蛋白的合成有关。本实验旨在阐明GlyRS对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）乳蛋白、乳脂、乳糖以及细胞增殖的影响。从而初步揭示GlyRS是一个新的调节BMECs乳合成的信号分子。
　　本研究采用了组织块培养法，体外培养并得到了纯化的BMECs。利用免疫荧光(IF)和蛋白质免疫印记(WB)检测细胞中角蛋18(CK18)和β-Casein(CSN2)的表达，以鉴定细胞的纯度和泌乳功能。
　　实验通过在细胞培养液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸(Met)或10％的胎牛血清(FBS)建立一个体外细胞培养的泌乳模型。采用WB、IF以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等方法，检测添加Met或FBS后，乳糖和乳脂(TG)的分泌量，DNA数量，CSN2、GlyRS、p-GlyRS(T544，S704)的表达量以及p-GlyRS(T544，S704)的定位情况。结果表明，添加Met或FBS可以促进细胞乳糖和乳脂的分泌，增加DNA合成，显著提高CSN2、GlyRS以及p-GlyRS(T544，S704)的表达量，同时发现p-GlyRS(T544，S704)在细胞核中定位明显增加。这表明，在Met或FBS可以通过GlyRS调节BMECs乳合成以及细胞增殖。
　　利用纯化后的BMECs分别建立GlyRS过表达（pGCMV-IRES-EGFP-GlyRS）与干扰(GlyRS shRNA)的细胞泌乳模型，采用WB、IF、qRT-PCR和流式细胞术(flow cytometry，FCM)等方法，检测乳糖和乳脂的分泌量，DNA数量，细胞周期的分布以及GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、SREBP-1、CSN2、CyclinD1和β-1，4-galactosyltransferase2（β4Gal-T2）的表达。结果表明，当GlyRS过表达和抑制时，乳糖和乳脂的分泌量，细胞的DNA合成，处于S期和G2/M期的细胞数分别显著增加和降低。同时，GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1和CSN2的蛋白表达水平以及β4Gal-T2的mRNA表达量也均显著增加和降低。然而，mTOR和S6K1的蛋白表达水平无显著变化。这表明，GlyRS通过上调p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1以及β4Gal-T2的表达量，促进乳蛋白、乳脂以及乳糖的合成，同时提高BMECs增殖能力。
　　综上所述，GlyRS作为一个重要的信号分子，能接受营养物质（如Met，FBS）信号，正向调节BMECs的乳合成以及细胞增殖。其可能的调控机制如下:当GlyRS接受Met或FBS刺激后，其磷酸化蛋白水平增加，进入细胞核量增多，通过上调p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、β4Gal-T2以及Cyclin D1的表达，促进BMECs乳合成以及细胞增殖。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 乳腺上皮细胞乳合成和细胞增殖的基本规律

1．1．1 乳蛋白的合成

1．1．2 乳脂合成

1．1．3 乳糖合成

1．1．4 MECs的增殖

1．2 调控BMECs乳合成的细胞信号转导途径

1．2．1 mTOR途径对乳蛋白和乳脂合成的调控

1．2．2 SREBP-1途径对乳脂合成的调控

1．2．3 β4GalT对乳糖合成的调控

1．2．4 Cyclin D1对MECs增殖的调控

1．2．5 外源激素、生长因子和营养素对乳合成和细胞增殖的调控

1．3 氨基酰tRNA合成酶

1．3．1 氨基酰tRNA合成酶的基本结构

1．3．2 aaRSs的非经典功能

1．3．3 甘氨酰tRNA合成酶的非经典功能

1．4 实验的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 实验动物与细胞

2．1．4 试剂的配制

2．2 实验方法与步骤

2．2．1 BMECs的原代培养与纯化

2．2．2 BMECs的鉴定

2．2．3 添加Met、FBS的BMECs泌乳模型的建立

2．2．4 过表达GlyRS的BMECs泌乳模型的建立

2．2．5 抑制GlyRS的BMECs泌乳模型的建立

2．2．6 添加Met、FBS后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响

2．2．7 GlyRS过表达后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响

2．2．8 GlyRS抑制后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响

2．2．9 数据处理

3 结果与分析

3．1 BMECs的原代培养

3．2 加Met、FBS后对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响

3．2．1 加Met、FBS后对BMECs乳糖分泌的影响

3．2．2 加Met、FBS后对BMECs TG分泌的影响

3．2．3 加Met、FBS后对BMECs增殖的影响

3．2．4 Met、FBS调节BMECs中相关基因的表达

3．2．5 加Met、FBS后对p-GlyRS核定位的影响

3．3 GlyRS过表达后可上调BMECs的乳合成及细胞增殖

3．3．1 GlyRS过表达后增加BMECs的乳糖分泌

3．3．2 GlyRS过表达后增加BMECs的TG分泌

3．3．3 GlyRS过表达后促进DNA合成及加快细胞周期转换

3．3．4 GlyRS过表达后增加β4Gal-T2的mRNA表达量

3．3．5 GlyRS过表达后增加相关蛋白的表达

3．4 GlyRS抑制后可下调BMECs的乳合成及细胞增殖

3．4．1 GlyRS干扰片段的筛选

3．4．2 GlyRS抑制后减少BMECs乳糖的分泌

3．4．3 GlyRS抑制后减少BMECs中TG的分泌

3．4．4 GlyRS抑制后减少DNA合成及减缓细胞周期转换

3．4．5 GlyRS抑制后降低β4Gal-T2的mRNA表达量

3．4．6 GlyRS抑制后增加相关蛋白水平的表达

4 讨论

4．1 BMECs的原代培养、纯化及鉴定

4．2 Met和FBS对BMECs乳合成及细胞增殖的影响

4．2．1 Met和FBS对乳蛋白、乳脂及乳糖合成的影响

4．2．2 Met和FBS对BMECs增殖能力的影响

4．2．3 Met和FBS对GlyRS表达的影响

4．2．4 Met和FBS对p-GlyRS表达及入核的影响

4．3 GlyRS对BMECs乳合成以及细胞增殖的影响

4．3．1 GlyRS对BMECs乳蛋白合成的影响

4．3．2 GlyRS对BMECs乳脂合成的影响

4．3．3 GlyRS对BMECs乳糖合成的影响

4．3．4 GlyRS过表达与抑制对p-GlyRS表达的影响

4．3．5 GlyRS对细胞增殖的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文