ZEN降解酶和DON降解酶在黑曲霉中的表达

摘要

玉米赤霉烯酮(ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是由镰刀菌代谢产生的真菌毒素，在全球的污染情况极其普遍，不但给世界粮食产业造成巨大经济损失而且也给世界的食品安全造成了困扰。人们认识和利用传统的毒素清除方法包括物理和化学方法。虽然利用物理法可以清除真菌毒素，但是并不能将其完全清除，而且能使食物原有的一些营养物质的结构发生改变，具有一定的缺陷。化学方法需要利用某些化学试剂来达到清除毒素的目的，但是化学试剂又有一些不被研究者知道的危险因子，所以也存在安全性的问题。生物去毒方法有很强的特异性、效率较高而且具有不会对环境造成污染的优点，逐渐引起了研究者的广泛关注。
　　到目前为止尽管已经筛选和构建了一些ZEN和DON降解菌。但是由于降解能力低和无法保障安全性等原因，因此离实际应用还有一定的差距。
　　本研究利用食品级黑曲霉表达系统表达ZEN降解酶和DON降解酶，尝试利用不同的信号肽、融合蛋白和密码子优化等策略提高ZEN降解酶和DON降解酶的表达量，以期获得安全高效的ZEN和DON降解菌。
　　本实验主要研究结果如下:
　　1.构建了表达载体p10-6-ZEN、p10-6-OZEN、p10-6-2-α-factor-ZEN、p10-6-2-α-factor-OZEN、p10-6-DON、 p10-6-ODON、 p10-6-2-α-factor-DON、p10-6-2-α-factor-ODON。
　　2.通过冻融法将构建的表达载体转入农杆菌内，然后利用农杆菌介导法转化黑曲霉，通过PCR鉴定获得了8株同源重组转化子，即p10-6-ZEN、p10-6-OZEN、p10-6-2-α-factor-ZEN、p10-6-2-α-factor-OZEN、p10-6-DON、p10-6-ODON、p10-6-2-α-factor-DON、p10-6-2-α-factor-ODON,其中p10-6-ZEN、p10-6-DON为纯合菌株，其余6株为非纯合菌株。
　　3.将获得的8株同源重组菌株进行摇瓶发酵，收集表达ZEN降解酶基因菌株5-7d的上清液，收集表达DON降解酶基因菌株5d的发酵上清进行检测分析。利用SDS-PAGE检测其蛋白水平的表达，但是结果没有发现明显的目的条带。Western Blot检测结果显示ZEN降解酶基因得到了微量表达。酶活检测结果表明重组菌株发酵液上清对ZEN和DON有微弱的降解作用。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 研究目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 玉米赤霉烯酮的化学结构

1．2．2 玉米赤霉烯酮(ZEN)的毒性研究

1．2．3 玉米赤霉烯酮的污染情况

1．2．4 玉米赤霉烯酮(ZEN)的检测方法

1．2．5 玉米赤霉烯酮(ZEN)的清除方法

1．2．6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的结构及性质

1．2．7 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的毒性研究

1．2．8 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的污染情况

1．2．9 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的检测方法

1．2．10 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的清除方法

1．2．11 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与载体

2．1．2 酶和主要生物化学试剂

2．1．3 常用试剂的配制

2．1．4 培养基

2．1．5 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 黑曲霉基因组DNA的提取

2．2．2 基因克隆

2．2．3 根癌农杆菌介导的黑曲霉的遗传转化

3 结果与分析

3．1 黑曲霉表达载体的构建

3．1．1 表达载体p10-6-ZEN的构建

3．1．2 表达载体p10-6-OZEN的构建

3．1．3 表达载体p10-6-2-α-factor-ZEN的构建

3．1．4 表达载体p10-6-2-α-factor-OZEN的构建

3．1．5 表达载体p10-6-DON的构建

3．1．6 表达载体p10-6-ODON的构建

3．1．7 表达载体p10-6-2-α-factor-DON的构建

3．1．8 表达载体p10-6-2-α-factor-ODON的构建

3．2 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化

3．2．1 冻融法转化农杆菌

3．2．2 农杆菌介导法转化黑曲霉

3．3 同源重组转化子的鉴定

3．3．1 阳性转化子的鉴定

3．4 同源重组菌株的鉴定

3．5 ZEN和DON降解酶在重组菌株中的表达检测

3．5．1 ZEN和DON降解酶的SDS-PAGE检测

3．5．2 Western Blot检测ZEN降解酶的表达

3．5．3 液相色谱法测定ZEN和DON降解酶的表达

4 讨论

4．1 黑曲霉表达系统

4．2 ZEN降解酶基因和DON降解酶基因在黑曲霉的表达

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文