重组有机磷降解酶基因、其表达载体及重组有机磷降解酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种新的人工合成的适合在真核细胞中表达的有机磷降解酶基因，该人工基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明基因通过对原有机磷降解酶基因进行分子改造和修饰，再经人工合成制备得到，改造后的重组基因与原始基因相比，共改变了154个碱基，涉及到135个氨基酸，G+C含量由原来的62.89％变为50.27％，适合在真核细胞中高效表达。本发明还提供了含有上述基因的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞以及制备重组有机磷降解酶的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工基因，尤其涉及一种人工合成的编码有机磷降解酶的基因，包含该基因的重组酵母表达载体，该重组酵母表达载体所转化的宿主细胞以及重组有机磷降解酶的制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

据中国统计年鉴显示，我国化学农药年产量约100万吨，居世界第二位。其中高毒的杀虫剂产量在我国农药中名列第一，占农药总产量的70％。我国又是农药的使用大国，每年化学防治面积约44亿亩次，仅对于蔬菜就可挽回病虫害造成的损失4800万吨，包括粮食、棉花、水果在内，挽回的总价值在500亿元左右。然而，农药的残留问题普遍存在。同时，在杀虫剂中多数为高毒的有机磷农药，但农药的利用率只有10-20％，其残留进入土壤和水体，严重破坏了农田生态系统，并危害了人民健康，还直接影响了农产品的销售和出口创汇。

以茶叶为例，我国每年出口茶叶20万吨左右，居世界第二，贸易金额约4亿美元，出口量占我国茶叶生产总量的1/3。欧盟是我国茶叶出口的一个重要市场，贸易额达7000万美元。但是，近两年来，欧盟对茶叶农药残留限量的规定项目不断增多，限值大幅降低，严重阻碍了我国茶叶的对欧出口。

我国是农业大国，发展绿色农产品是二十一世纪农业发展的方向。国际市场对我国农产品的贸易壁垒已不复存在，而技术壁垒，尤其是农药残留问题则成为主要的限制因素。解决农产品的农药残留污染，不仅可以提高我国农产品的质量，满足人们对安全农产品的需求，同时有利于出口创汇，增加农民的收益。因此，如何清除农药残留，已成为迫切需要解决的问题。

有机磷农药是农药中的主要类别，是农业生产必不可少的。但有机磷农药具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能，对人存在着程度不同的毒性。随着人们生活质量的提高和环保意识的加强，有机磷农药的残留毒性问题越来越受到人们的关注。

自1973年Sethunarhan和Yoshida(Sethunathan，N.，and T.Yoshida.AFlavobacterium that degrades diazinon and parathion.Can.J.Microbiol.1973.19：873-875)从接触过有机磷农药的土壤中分离出第一株有二嗪农和对硫磷降解活性的黄杆菌以来，人们不断的发现出一些土壤微生物(细菌、真菌)能够降解有机磷农药，这主要是由于它能够分泌一种酶降解有机磷，同时降解后的产物可作为微生物生长的碳、氮、磷源，为其生长提供营养[(Chaudhry，G.R.，A.N.Ali，and W.B.Wheeler.Isolation of a methyl parathion-degradingPseudomonas sp.that possesses DNA homologous to the opd gene from aFlavobacterium sp.Appl.Environ.Microbiol.1988.54：288-293；Zboinska E.，et al：Organophosphonate utilization by the wild-type strain of Pseudomonas fluorescens.Appl Environ Microbiol.1992 Sep；58(9)：2993-9.；李淑彬，周仁超等：曲霉M-2降解有机磷农药(甲胺磷)的研究。微生物学通报，1999，26(1)：27-30)]。

有机磷通常含有三个磷酯键，所以常被称为磷酸三酯。一般有机磷被分为两种类型，一是磷通过双键与氧结合(P＝O)，如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是磷通过双键与硫结合(P＝S)，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱(乐斯本)等。有研究表明，如果有机磷中的一个磷酸酯键被水解将大大降低其毒性，以对硫磷为例，将使其毒性降低100倍(Serdar，C.M.，and D.T.Gibson.Enzymatic hydrolysis of organophosphates：cloning and expression of a parathion hydrolase gene from Pseudomonas diminuta.Bio/Technology.1985.3：567-571；Serdar，C.M.Hydrolysis of cholinesteraseinhibitors using parathion hydrolase.U.S.patent.December 1996.5,589,386)。因此，破坏有机磷的磷酯键是降低有机磷农药毒性行之有效的方法。

有机磷农药降解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.1)可降解有机磷农药分子，破坏有机磷的磷酯键而使其脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法(虞云龙等，1996，农药微生物降解的研究现状与发展策略，环境科学进展，1996，Vol.4，No.3，28～36)。对于有机磷农药降解酶的分子生物学研究随着人们对农药残留的认识而不断深入。DiSioudi等人(DiSioudi，B.，Miller，C.，Lai，K.，Grimsley，J.and Wild，J.Rational design of organophosphorushydrolase for altered substrate specificities.Chem.Biol.Interact.1999，14：211-223；DiSioudi，B.，Grimsley，J.Lai，K.，and Wild，J.Modification of nearactive site residues organophosphorus hydrolase reduces metal stoichometry andalters substrate specificity.Biochemistry，1999，38(10)：2866-2872)研究了其编码基因的结构，并进行了分子改造，使其改变了底物特异性，从而能对多种有机磷农药具有高效的降解效率。同时，人们还将农药降解酶基因克隆到大肠杆菌中，并使其在细胞表面表达，增加其降解效率[Wu CF，Valdes JJ，Rao GBentley WE.Enhancement of organophosphorus hydrolase yield in Escherichiacoli using multiple gene fusion.Biotechnol Bioeng.2001，75(1)：100-103；Cho CM，Mulchandani A，Chen W.Bacterial cell surface display of organophosphorushydrolase for selective screening of improved hydrolysis of organophosphate nerveagents.Appl.Environ.Microbiol.2002，68(4)：2026-2030]。

Wu Ningfeng等从农药污染的土壤中分离得到一株高效降解有机磷农药的细菌，经鉴定为假单胞假产碱菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(此菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC1150)，同时，对此细菌产生的有机磷降解酶OPHC2进行了分离纯化及酶学性质的研究[Wu Ningfeng，Deng Minjie，et al：Isolation，purification andcharacterization of a new organphosphorus hydrolase OPHC2.Chinese ScienceBulletin，2004，49(3)：268-272]，并从中克隆了有机磷降解酶的编码基因[WuNingfeng，Deng Minjie，et al：Cloning and expression of ophc2，a neworganphosphorus hydrolase gene.Chinese Science Bulletin，2004，49(12)：1245-1249](编码基因的核苷酸序列已在GenBank中登录，登录号为AJ605330)。

但有机磷降解酶在原菌和重组原核表达系统大肠杆菌中的表达量都不高，在原菌中的表达量约为0.2U/mL发酵液，在大肠杆菌中诱导表达也仅为2U/mL，达不到廉价大规模生产的目的。利用酵母表达系统可允许将外源基因插入到含有信号肽的载体上，使表达的外源蛋白能够分泌到培养液上清中，不需要破壁就可以得到酶蛋白，减化了酶蛋白的后加工工艺，特别有利于酶蛋白的大规模生产。因此，很有必要将原有机磷降解酶基因进行分子改造和修饰，使改造后的有机磷降解酶基因能够在酵母细胞中高效表达重组有机磷降解酶，为工业化大规模廉价生产重组有机磷降解酶开辟一条新的途径。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服原有机磷降解酶基因(该基因在GenBank中的登录号为AJ605330)表达效率不高的缺陷，将原有机磷降解酶基因进行分子改造和修饰，得到一种能够在酵母细胞中高效表达有机磷降解酶的人工基因。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种编码有机磷降解酶的人工核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该人工核苷酸序列能够在酵母细胞中高效表达重组有机磷降解酶。

将外源基因克隆到宿主细胞进行表达，会受到许多因素的影响，包括启动子效率、5’端非编码区序列、转录的有效终止、外源蛋白的稳定性以及外源结构基因本身等。本发明综合影响基因高效表达的分子生物学最新研究进展，对来源于原核微生物的有机磷降解酶基因进行了分子改造，使其能在真核表达系统中，尤其是能够在酵母表达系统中高效表达。本发明是基于以下总体原则对原有机磷降解酶基因进行分子改造：1.不改变原有乳糖酶基因所编码的氨基酸序列；2.按照毕赤酵母密码子的选择偏向对密码子进行优化(赵翔，霍克克，李育阳.毕赤酵母的密码子用法分析，生物工程学报.2000，16(3)：308～311)；3.避免一些可能降低表达的序列。分子改造后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，改造后的有机磷降解酶基因与原始基因相比，共改变了154个碱基，涉及到135个氨基酸，G+C含量由原来的62.89％变为50.27％，更适合在真核细胞中表达。

本发明所要解决的另一技术问题是构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组酵母表达载体及获取含有该重组酵母表达载体的重组酵母细胞。

本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种重组酵母表达载体，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明的重组酵母表达载体可通过本领域的常规方法构建而成，即将将SEQID NO.1所示的核苷酸序列插入到酵母表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列可操作的与酵母细胞表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达载体pPIC9-ophc2-m。

本发明所构建的重组酵母表达载体可通过常规的方法转化宿主细胞，所述的宿主细胞可为毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸酵母细胞(Hansenula polymorpha)。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将重组酵母表达载体pPIC9-ophc2-m转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组酵母细胞：毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115/pPIC9-ophc2-m。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种制备有机磷降解酶的方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种制备有机磷降解酶的方法，包括以下步骤：

培养用本发明重组酵母表达载体所转化的重组酵母细胞，诱导重组有机磷降解酶的表达，回收并纯化所表达的有机磷降解酶。

上述制备有机磷降解酶的方法中，优选的，所述的重组酵母表达载体是酵母表达载体pPIC9-ophc2-m；所述的重组酵母细胞是毕赤酵母细胞(Pichicpastoris)GS115/pPIC9-ophc2-m。

本发明毕赤酵母表达的重组有机磷降解酶在发酵液中含量占总分泌蛋白的90％以上，通过SDS-PAGE仅看到少量杂蛋白的存在，因此只需将发酵液经过脱盐纯化处理，无需进一步处理即可得到纯化的重组有机磷降解酶。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种利用本发明重组酵母细胞[毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115/pPIC9-ophc2-m]大规模发酵生产重组有机磷降解酶的方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种利用本发明重组酵母细胞[毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115/pPIC9-ophc2-m]大规模发酵生产重组有机磷降解酶的方法，由种子培养、菌体生长阶段、碳源饲喂阶段、碳源-甲醇混合饲喂阶段和甲醇诱导表达阶段五个常规发酵生产酶的步骤所组成，其中在甲醇诱导表达阶段时，所采用下述条件进行诱导表达重组有机磷降解酶：向每1升发酵液每1小时流加3.0ml含有12ml/l PTM1的甲醇以诱导表达重组有机磷降解酶，诱导的时间为120-144小时；流加氨水调节发酵液的pH值为5.4-5.6。

综上所述，本发明成功的合成了能够在酵母细胞中高效表达重组有机磷降解酶的人工有机磷降解酶基因，并成功构建了该基因的重组表达载体并筛选得到高表达的工程菌株(该工程菌株命名为GS-OPHC2-55)，建立了制备重组有机磷降解酶的方法及工业化大规模发酵生产重组有机磷降解酶的最佳方法。本发明重组有机磷降解酶在3升发酵罐的表达量高达6克/升，重组酶纯化后的酶学性质分析表明，其酶学性质优良；对不同的有机磷农药的降解实验表明，其具有较高的酶活性和降解广谱性，为工业化大规模生产重组有机磷降解酶开辟了一条新的途径。

附图说明

图1酵母重组质粒pPIC9-ophc2-m酶切鉴定结果；

图2酵母染色体上的有机磷降解酶基因的PCR检测结果；

图3发酵液中重组有机磷降解酶蛋白的SDS-PAGE电泳图谱；

图4重组有机磷降解酶蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图谱；

图5温度对重组有机磷降解酶反应的影响；

图6本发明重组有机磷降解酶的温度稳定性；

图7pH对本发明重组有机磷降解酶反应的影响；

图8本发明重组有机磷降解酶的pH稳定性。

以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

一、试验材料和试剂

1、生化试剂、酶、试剂盒：

限制性内切酶为TaKaRa及BioLabs公司产品、连接酶为Promega公司产品、Taq酶为上海生工生物工程公司产品，T₄多聚核苷酸激酶为TaKaRa公司产品；DNA回收试剂盒购于宝生物工程公司、T载体连接试剂盒购于Promega公司，丙烯酰胺、N，N′-亚甲叉丙烯酰胺、无氨基酸酵母氮源(YNB)、生物素(Biotin)、琼脂糖购自Sigma公司。其他生化试剂均购于Sigma、Promega及北京化学试剂公司。

2、质粒与菌株：

毕赤酵母(Pichic pastoris)表达系统(包括酵母受体菌株Pichic pastorisGS115，质粒pPIC9)购自美国Invitrogen Corporation公司；pBS-T载体购于北京天为时代科技有限公司。

3、培养基：

1)完全培养基YPD：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5％琼脂)。

2)转化培养基RDB：酵母氮源(Yeast Nitrogen Base W/O amino acids，YNB)13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10^-4g/L，山梨醇186g/L，0.05g/L谷氨酸，0.05g/L甲硫氨酸，0.05g/L赖氨酸，0.05g/L亮氨酸，0.05g/L异亮氨酸，琼脂粉20g/L。

3)选择培养基MD：YNB 13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L。

4)选择培养基MM：YNB 13.4g/L，甲醇5mL/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L。

5)诱导表达培养基BMGY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10mL，pH6.0。

6)诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇5mL/L，pH6.0。

7)重组酵母发酵培养基：磷酸26.7mL/L，CaSO₄0.93g/L，K₂SO418.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，葡萄糖50g/L。

8)发酵中所用的微量盐溶液(PTM1)：硫酸铜6.0g/L、碘化钠0.08g/L、硫酸锰3.0g/L、钼酸钠0.2g/L、硼酸0.02g/L、氯化钴0.5g/L、氯化锌20g/L、硫酸亚铁65g/L、生物素0.25g/L、硫酸5mL/L。

9)LB完全培养基：NaCl，10g/L；蛋白胨；10g/L；酵母粉，5g/L。121℃灭菌20分钟，固体培养基加入1.5％琼脂。

4、DNA测序、引物合成：

委托上海基康生物技术有限公司进行DNA测序；委托北京奥科生物技术公司合成所有实验用的引物。

[实施例1]重组有机磷降解酶基因的合成与克隆

1、根据毕赤酵母密码子的选择偏向，在不改变原有有机磷降解酶基因[该基因序列详见：Wu Ningfeng，Deng Minjie，et al：Cloning and expression ofophc2，a new organophosphorus hydrolase gene.Chinese Science Bulletin，2004，49(12)：1245-1249]所编码的氨基酸序列的前提下，对有机磷降解酶基因成熟蛋白编码序列的密码子进行了优化设计。

改造后的有机磷降解酶基因与原始基因相比，共改变了154个碱基，涉及到135个氨基酸，G+C含量由原来62.89％变为50.27％，适合在毕赤酵母中表达。

将改造后的全基因序列分为A、B、C三大段，然后再进一步将大片段分成50bp左右大小的小片段，A：C1-1-C1-6，互补链CR1-1-CR1-6；B：C2-1一C2-7，互补链CR2-1-CR2-7；C：C3-1-C3-6，互补链CR3-1-CR3-6；共38段寡聚DNA片段分别进行合成。寡聚DNA片段的合成工作由奥科生物技术公司完成。

2、合成的DNA小片段分别用去离子水溶解，使其终浓度为20pmol/L，再对他们分别进行磷酸化，在10μl反应体系中，加入3UT₄多聚核苷酸激酶和三磷酸腺苷(ATP，终浓度为0.2mmol/L)，37℃水浴保温30min。然后，将各DNA小片段按A、B、C组分别合并成三管，95℃水浴保温5min，自然冷却至室温。

3、为便于进行克隆操作，以及考虑到目的基因片段在载体上的正确插入方向，合成三段大片段A、B、C的时候，在A片段的5’端依次设计了XhoI、SnaBI酶切位点，在3’端添加了HindIII酶切位点；在B段5’端和3’端分别添加HindIII和SpeI酶切位点，在C段5’端和3’端分别添加SpeI和NotI酶切位点。琼脂糖检测合格的各条大片段直接与用相应限制性内切酶处理好的pBS-T载体(购自天为时代公司)连接，电击转化入大肠杆菌JM109，送去测序，测序工作由上海基康生物技术有限公司完成。

4、测序正确的大片段再连成完整的ophc2-m基因：先将A和B拼接在pBS-T上，然后把片断C切下连到带有AB片段的pBS-T上，得到带有完整改造基因的重组子pBS-ophc2-m，重组质粒转化大肠杆菌JM109，涂布LB(含氨苄100μg/mL)平板，挑选单菌落进行培养，提取培养物的质粒，进行酶切、电泳检测，显示酶切条带与合成的片段大小一致，初步认定获得了阳性重组克隆子。为了进一步确证，对该重组子进行了序列测定，测序工作由上海基康公司完成，序列测定结果进一步证实SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列已成功的插入到pBS-T载体的正确位置中。

[实施例2]酵母重组质粒的构建

将检测正确的重组质粒pBS-ophc2-m和质粒pPIC9分别用SnaBI/NotI进行双酶切处理，电泳回收后，用T₄DNA连接酶(Promega公司)连接。这样，利用酶切位点将目的基因定向插入到pPIC9上的SnaBI和NotI位点之间，形成重组子pPIC9-ophc2-m，重组子的酶切鉴定见图1。从而，将目的基因克隆到AOX1启动子下游，并且与信号肽编码序列形成了正确的阅读框架。

[实施例3]转化、检测和高表达有机磷降解酶工程菌的筛选

1、受体酵母的转化：大量提取实施例2所制备的酵母重组表达质粒pPIC9-ophc2-m，取10μg用稍过量的BglII作线性化处理，电泳检测酶切是否完全，线性化好的质粒DNA用酚氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，离心，弃上清液，70％乙醇洗两次，无菌水溶解。然后，取线性DNA 1～5μg与80μL酵母GS115感受态细胞混合后，注入预冷的无菌电击杯(0.2cm，BioRad)中，轻敲电击杯，使混合物落入电击杯底部，在电击仪(BioRad)上设定电压为2.5kV，电容为25μF，电阻为400Ω，进行电转化操作。电转化后，立即向电击杯中加入1mL预冷的1mol/L山梨糖醇，混匀后立即涂布RDB平板，每板涂布200μL。倒置平板于28～30℃培养箱，培养至转化子出现(约60小时)。

用无菌牙签从转化平板上挑取单菌落，依次接至MM、MD固体培养基上，倒置平板于28～30℃培养箱，培养至转化子出现(约48小时)。筛选在MD平板上生长正常但在MM平板上生长缓慢或完全不生长的克隆子(his⁺，mut^s)。为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中有机磷降解酶的表达情况。将his+mut^s转化子首先在BMGY培养基中培养，待其生长至饱和状态后，5000rpm离心4min，弃BMGY，换入诱导培养基BMMY，在诱导培养48h后，将培养物10000rpm离心3min，取上清液按下述方法进行有机磷降解酶活性测定：

取100μL待测酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基对硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)缓冲液的体系中，37℃保温10分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃溶液显色，410nm测定OD值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。一个酶的活性单位(U)定义为在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量。

有机磷降解酶酶活单位计算公式：

其中：3×10^-3：反应总体积(L)；N：酶液的稀释倍数；10^①：将100μL稀释酶液中的酶活性折算为1mL的酶活性；10^②：反应时间。

表1列出了酶活性测定结果。根据测定结果，酶表达量高的4株重组子为7^#，9^#，55^#，67^#，其中55^#重组子表达有机磷降解酶最高，将其命名为GS-OPHC2-55，用于实施例4和实施例5中发酵法生产重组有机磷降解酶的工程菌株。

表1不同转化子的酶活性测定结果

  菌株  酶活U/mL  7  2.221  9  2.707  15  1.267  20  1.134  27  1.709  48  1.947  55  2.486  59  1.568  67  2.071  69  1.788  77  1.886  83  1.674

2、酵母染色体上的有机磷降解酶基因的PCR检测：28℃培养10mL待检测重组酵母48h，离心收集菌体，在液氮中研磨成粉末，加入预冰冷的提取液0.4mL(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，100mmol/L EDTA pH8.0)，振荡混匀；加入50μL 10％SDS，37℃保温1h，；再加入75μL 5mol/L NaCl，轻轻混匀，然后加入65μL CTAB/NaCl(10％CTAB，0.7mol/L NaCl)混合液，65℃下保温10-20min，依次用等体积的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提，上清液用终浓度75％的异丙醇沉淀，沉淀用70％乙醇洗涤2次后，真空干燥，溶于水，得到重组酵母的基因组。以它为模板，5’端引物ophc2-5-2：tacgtagccgcaccggcacaacagaag(SEQ ID NO：2)，3’端引物ophc2-3：tcagcggtcg ctacggatcgg(SEQ ID NO：3)，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示在约900bp处出现了一条带，与插入基因大小相符，证实了有机磷降解酶基因已整合在酵母染色体上(见图2)。

[实施例4]3升发酵罐发酵生产重组有机磷降解酶

选取摇床水平上有机磷降解酶表达量最高的转化子GS-OPHC2-55^#作为工程菌株、采用3升发酵罐来发酵生产重组有机磷降解酶。

1、种子培养：首先挑取转化子GS-OPHC2-55^#的单菌落接种于20mL YPD液体培养基中，28℃摇床培养过夜，再以10％的接种量转接于200mLYPD培养基中，28℃摇床培养24h，然后以10％的接种量接种于2L发酵培养基中开始发酵。

2、菌体生长阶段：以10％接种量接入种子液，30℃通气搅拌培养18-24h，同时流加氨水调节pH为4.5-5.0左右，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重将达到85g/L。

3、碳源饲喂阶段：流加25％葡萄糖(包含12mL/L PTM1微量盐溶液)，流加量为36/h/L，同时流加氨水调节pH为4.5-5.0左右，培养5-6h。调整通气量使溶氧量始终大于20％，此时菌体湿重将达到150g/L。

4、碳源-甲醇混合饲喂阶段：流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，同时流加氨水调节pH为5.2-5.5，控制溶氧量始终大于20％。

5、诱导表达阶段：流加甲醇(含12mL/L PTM1)，流加量为每1升发酵液每1小时流加3.0mL甲醇以诱导表达，同时流加氨水调节pH为5.4-5.6，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每隔12h取样一次测定表达的有机磷降解酶的活性，并同时进行SDS-PAGE监测表达量的累积。

共进行了三次3L发酵罐发酵实验，结果表明，甲醇未诱导之前，在菌株培养和碳源饲喂两个阶段内，菌体快速增长，其湿重可达150～200g/L，此时在发酵液上清中检测不到有机磷降解酶活性。随着甲醇的诱导时间的延长，发酵液中的有机磷酶活性逐渐增加，诱导120h后发酵液中有机磷降解酶活性约为10.1U/mL(表2)。SDS-PAGE同时表明发酵液中有机磷降解酶蛋白表达量也在不断积累(见图3)，诱导120h后有机磷降解酶的表达量达到6克/升。

表23升发酵罐中有机磷降解酶经甲醇诱导不同时间的

           酶活性及菌体的湿重

  发酵时间(小时)  酶活(U/mL)  菌体湿重(g/L)  12  3.452  152  24  4.278  176  36  5.966  196  48  6.365  210  60  6.945  223  72  8.369  225  84  9.014  231  96  9.249  260  108  9.46  269  120  10.146  273

[实施例5]3吨发酵罐发酵生产重组有机磷降解酶

选取摇床水平上有机磷降解酶表达量最高的转化子GS-OPHC2-55^#作为工程菌株、采用3吨发酵罐来发酵生产重组有机磷降解酶。培养基的体积为1.5吨，其主要发酵步骤与实施例4相同，具体分为以下几个阶段：

1、种子培养：从斜面上刮下菌，接种至装有200mL YPD培养基的500mL三角瓶中，在28℃摇床上培养20-22小时后，转接至装有400mLYPD培养基的1000mL三角瓶中，在28℃摇床上继续培养20-22小时后，转入装有200L培养基的0.5吨的种子罐中，接种量为4％，培养16小时后开始测量菌体湿重和葡萄糖的含量，当葡萄糖的含量降为0时(20小时左右)，菌体的湿重达到70-80g/L，可以将种子转入到3吨的发酵罐中。

2、菌体生长阶段：29℃-30℃通气搅拌培养，流加氨水调节pH为4.5-5.0左右，12小时后取样测定菌体湿重和葡萄糖的含量，这时菌体湿重达到90g/L，糖含量降为0.2％，糖已基本消耗完，进入碳源饲喂阶段。

3、碳源饲喂阶段：开始补加葡萄糖(工业级25％)，补加量为60L/h，共补加7小时，同时流加氨水调节pH为4.5-5.0左右，此时的菌体湿重达到140g/L左右，进入混合饲喂阶段。

4、碳源-甲醇混合饲喂阶段：这个阶段主要的目的是让酵母细胞适应诱导剂甲醇，一般为5-6小时，流加25％葡萄糖16L/h，甲醇2L/h，同时流加氨水调节pH为5.2-5.5，混合饲喂阶段完成后菌体湿重基本没有变化，仍为140g/L左右。

5、诱导表达阶段：这个阶段主要的目的是细胞高密度发酵，同时在诱导剂甲醇的诱导下使目的蛋白高效表达，一般要诱导120-144小时，甲醇的流加量为流加量为每1吨发酵液每1小时流加3升甲醇以诱导表达，同时流加氨水调节pH为5.4-5.6。随着甲醇的诱导时间的延长，菌体的湿重不断增加，发酵液中的有机磷酶活性也逐渐增加，下罐前菌体的湿重达到240g/L左右，发酵液中有机磷降解酶活性为20.0U/mL左右。

[实施例6]本发明重组有机磷降解酶的纯化及酶学性质分析

本发明上述实施例中毕赤酵母表达的重组有机磷降解酶在发酵液中含量占总分泌蛋白的90％以上，通过SDS-PAGE仅看到少量杂蛋白的存在，因此只需将发酵液经过脱盐纯化处理，无需进一步处理即可得到纯化的重组有机磷降解酶。

具体脱盐纯化处理方法如下：首先用0.02mol/L的Tris-Cl(pH8.0)缓冲液平衡脱盐柱Hiprep Desalting 26/10，流速为5mL/min，待平衡2个柱体积后取2mL发酵液上样，依然用0.02mol/L的Tris-Cl(pH8.0)缓冲液洗脱2个柱体积，流速为2mL/min，分部收集，每管1mL。分别测定各收集管中溶液的有机磷降解酶活性，选取酶活最高的一管，并经SDS-PAGE验证该管纯化后的重组有机磷降解酶为单一条带，结果见图4。以此纯化后的酶进行以下酶学性质的研究：

1、本发明重组有机磷降解酶反应最适温度及热稳定性研究：以纯化的重组有机磷降解酶为材料，在不同温度下进行酶促反应后，如上所述(实施例2中有机磷降解酶活性测定方法)测定其酶活性，得到其最适反应温度；在65℃和75℃下分别处理酶液，处理时间为2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟，处理后在37℃下测酶活性，以确定其热稳定性。结果表明，其最适反应温度为65℃。温度在低于65℃时，随着温度升高酶活性逐步上升，但在20℃时相对酶活仍有23.9％。高于65℃酶活力迅速下降，到80℃时有最大活力的29.2％(见图5)。图6为重组有机磷降解酶的热稳定性曲线，65℃此酶很稳定，保温30分钟后，其相对酶活有78.6％；75℃下保温30分钟，其酶活性有所下降，但相对酶活仍有66.8％，说明本发明重组有机磷降解酶有很好的耐热性。

2、本发明重组有机磷降解酶反应的最适pH及pH稳定性：以纯化的重组有机磷降解酶为材料，在不同的pH下如上所述进行酶促反应，测定了其最适pH；将酶液在不同pH的缓冲液中于37℃保温30分钟后，测酶活性以确定其pH稳定性；测定结果表明，其最适反应pH为9，但在pH5.8-10的范围内，酶的相对活力均在60％以上，说明其有很宽的pH酶解范围，见图7。在不同pH下保温30分钟后，酶的相对活力影响不大，即使是pH5其相对酶活也达到51.3％，且在碱性条件下更加稳定(见图8)。

[实施例7]本发明重组有机磷降解酶对不同有机磷农药的降解实验

将本发明实施例6所纯化的重组有机磷降解酶用于降解不同的有机磷农药，实验结果见表3。

             表3重组酶对不同有机磷农药的降解实验

  农药名称  未经有机磷降解酶处理样品  的农药检出量(mg/kg)  经本发明重组有机磷降解  酶处理样品后的农药检出  量(mg/kg)  降解率  (％)  甲基对硫磷  19.35  未检出  100  氧化乐果  30.75  1.26  95.9  杀螟松  2.15  0.29  86.5  对硫磷  13.8  4.3  68.8  敌敌畏  36.3  11.45  68.5  辛硫磷  60.8  22.65  62.7  马拉硫磷  11.4  4.9  57.0  倍硫磷  10.2  5.6  45.1  毒死蜱  24.0  14.0  41.7

注：酶反应体系为：1.9mL缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0)+0.1mL有机磷降解酶液(0.5U)+5μL农药。反应温度：37℃；反应时间：20分钟。

实验结果表明，本发明重组有机磷降解酶对多种有机磷农药具明显的降解效果。

                         序列表.txt

SEQUENCE LISTING

<110>  中国农业科学研究院生物技术研究所

<120>  重组有机磷降解酶基因、其表达载体及重组有机磷降解酶的制备方法

<130>  pt058

<160>  3

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  903

<212>  DNA

<213>  Artificial

<220>

<223>

<400>  1

gccgcaccag cacaacagaa gacccaagtt ccaggttact acagaatggc tttgggtgac    60

ttcgaggtca ctgctttgta cgacggttac gtagacttgc ctgcttcttt gcttaagggt    120

atcgatgaca aggacctgca atctctgttg gctagaatgt tcgttgcttc tgagaaaggt    180

gttcaaactg ctgtcaacgc ttacttgatc aacactggtg acaacttggt tttgattgat    240

accggcgccg cccagtgttt tggtccaact ctcggtgttg tgcagaccaa ccttaaagct    300

tccggttacc aaccagagca ggttgatact gttttgctta cccacttgca cccagaccat    360

gcttgtggtt tggtcaacgc cgacggttcc ccagcctacc caaatgctac cgttgaggtt    420

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atgcaaggta tgttcaagat ggctcaacaa gctgtcgcac catacgctaa gatgaacaag    540

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taa                                                                  903

<210>  2

<211>  27

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tacgtagccg caccggcaca acagaag                                        27

<210>  3

<211>  21

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<223>

<400>  3

                       序列表.txt

tcagcggtcg ctacggatcg g                                          21