桦褐孔菌多糖的结构、抗氧化活性及对慢性胰腺炎的影响

摘要

桦褐孔菌在俄罗斯，日本，荷兰和芬兰等国家的部分地区作为偏方缓解疼痛和炎症已经超过4个世纪。大量研究表明，桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharide）具有抗氧化和抗炎活性，可以缓解结肠炎、艾滋病和癌症等疾病。慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)是一种由遗传因素或环境因素引起的伴随有疼痛、纤维化、炎症反应及细胞坏死的疾病。而多糖可以有效缓解代谢疾病并作为益生源调节肠道菌群。本研究通过水提-醇沉法提取桦褐孔菌多糖，并使用DEAE-纤维素层析柱和Sephadex G-200层析柱进一步纯化桦褐孔菌多糖。采用物理和化学方法分析多糖的结构特征及抗氧化活性。使用二乙基二硫代氨基甲酸盐(diethyldithiocarbamate，DDC)腹腔注射获得慢性胰腺炎小鼠，通过小鼠体重变化、胰腺组织切片、羟脯氨酸水平、组织抗氧化能力、代谢相关酶含量以及细胞因子水平揭示多糖对慢性胰腺炎的缓解作用。通过小鼠粪便高通量测序结果分析慢性胰腺炎小鼠肠道菌群变化。本研究获得以下结果:
　　(1)采用水提-醇沉法提取获得桦褐孔菌粗多糖，经DEAE-纤维素层析柱纯化获得IOP-Ⅰ、IOP-Ⅱ和IOP-Ⅲ三个组分，得率分别为38.2％，9.3％和10.5％。IOP-Ⅰ组分得率和多糖含量均最高，故将该组分经Sephadex G-200层析柱再次纯化。最终获得IOP的多糖含量为98.6％。
　　(2) IOP为均质性的B-吡喃型多糖，分子量为32.5 kDa，单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，其摩尔比为9.8∶13.6∶29.1∶20.5∶21.6∶5.4。
　　(3) IOP浓度为1-5 mg/mL时，铁还原能力、DPPH自由基清除活性和羟自由基清除活性都随IOP浓度的增加而增强，且当浓度达到5 mg/mL时IOP的DPPH自由基清除活性和羟自由基清除活性均趋近于抗坏血酸。
　　(4) IOP可以提高慢性胰腺炎小鼠体重增长率、SOD、GSH-Px、TAOC以及代谢相关酶含量，降低羟脯氨酸、MDA和细胞因子水平，改善小鼠胰腺组织病理程度。这些结果表明IOP对DDC引诱的慢性胰腺炎小鼠有明显的缓解作用，且IOP-L、IOP-M和IOP-H三个剂量组随着IOP浓度的增加对慢性胰腺炎的缓解作用逐渐增强，IOP-H组效果最好。
　　(5)高通量测序结果表明，IOP可以有效调节肠道菌群的结构及多样性。聚类分析和主成分分析结果直观的说明了DDC引诱扰乱了肠道菌群的结构。在门水平上，DDC引诱减少了Bacteroidetes含量，增加了Firmicutes含量。在属水平上，减少了Lactobacillus，Bacteroides，unclassified S24-7,unclassified Lachnospiraceae,unclassified Prevotellaceae,Roseburia和Prevotella的含量，而增加了Alistipes，ncertae_Sedis，Helicobacter，Parabacteroides和ikenella。但IOP可以有效调节这些菌群的变化，使它们向正常小鼠方向转变。这些结果表明IOP能够有效调节慢性胰腺炎小鼠的肠道菌群。

目录

声明

摘要

1 前言

1．2 桦褐孔菌多糖概述

1．2．3 桦褐孔菌多糖的结构表征

1．2．4 桦褐孔菌多糖的生物活性

1．3 慢性胰腺炎的概述

1．3．1 慢性胰腺炎的发病机制

1．3．2 慢性胰腺炎的病理学特征及其诊断

1．3．3 慢性胰腺炎的治疗

1．3．4 慢性胰腺炎动物模型

1．4 肠道菌群的组成、功能及其研究方法

1．4．1 肠道菌群的组成

1．4．2 肠道菌群的功能

1．4．3 肠道菌群的研究方法

1．5 研究目的和意义

1．6 研究内容、技术路线及创新点

1．6．1 主要研究内容

1．6．2 本研究的技术路线

1．6．3 研究的创新点

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验动物

2．3 仪器与设备

2．4 主要化学试剂

2．5 桦褐孔菌多糖的制备

2．5．1 桦褐孔菌子实体粗多糖的提取

2．6．1 红外光谱分析

2．6．2 单糖组成测定

2．6．3 均质性及分子量测定

2．7．2 DPPH自由基清除能力

2．7．3 羟自由基清除能力

2．8 多糖对慢性胰腺炎的缓解作用

2．8．2 动物造模与试验设计

2．8．3 胰腺组织HE染色

2．8．4 羟脯氨酸及代谢相关酶含量测定

2．8．5 组织抗氧化能力测定

2．8．6 细胞因子含量测定

2．9 多糖对慢性胰腺炎小鼠肠道菌群的影响

2．9．1 粪便DNA的提取及纯化

2．9．2 Illumina MiSeq测序

2．9．3 生物信息学统计分析

2．10 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 葡萄糖标准曲线的拟合

3．2 多糖的分离与纯化

3．3 多糖结构特征分析

3．3．1 红外光谱分析

3．3．2 单糖组成分析

3．3．3 分子量及均质性分析

3．3．4 核磁共振13C-NMR分析

3．4 多糖体外抗氧化活性分析

3．4．1 铁还原能力分析

3．4．2 DPPH自由基清除活性分析

3．4．3 羟自由基清除活性分析

3．5 多糖对慢性胰腺炎的缓解作用

3．5．1 毒性试验

3．5．2 小鼠体重和体重增长率

3．5．3 胰腺组织切片

3．5．4 羟脯氨酸含量测定

3．5．5 组织抗氧化能力测定

3．5．6 代谢相关酶含量测定

3．5．7 细胞因子含量测定

3．6 多糖对慢性胰腺炎小鼠肠道菌群的影响

3．6．1 OTU，多样性及丰富度分析

3．6．2 聚类分析

3．6．3 主成分分析

3．6．4 肠道菌群主要OTUs组成分析

3．6．5 门水平肠道菌群组成分析

3．6．6 属水平肠道菌群组成分析

4 讨论

4．1 桦褐孔菌多糖的结构特征与抗氧化活性

4．2 桦褐孔菌多糖对慢性胰腺炎的缓解作用

4．3 桦褐孔菌多糖对慢性胰腺炎小鼠肠道菌群的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文